[發明專利]富勒烯單加成線肽及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201410839223.7
• 申請日: 2014-12-30
• 公開（公告）號: CN104478994A
• 公開（公告）日: 2015-04-01
• 發明（設計）人: 張靜;張曉磊;何婷
• 申請（專利權）人: 鄭州大學
• 主分類號: C07K5/103
• 分類號: C07K5/103;C07K7/06;C07K1/107;A61P39/06;A61P35/00
• 代理公司: 鄭州優盾知識產權代理有限公司 41125
• 代理人: 鄭園;孫詩雨

技術領域

本發明屬于醫藥領域，具體涉及一種富勒烯單加成線肽及其制備方法，該化合物大大的提高了富勒烯在極性溶液中的溶解度，提高了生物學利用度及其對細胞的靶向性問題。

背景技術

富勒烯C₆₀因具有特殊的物理、化學性質顯示了較獨特的生物學活性，可歸納為光敏性作用與非光敏性作用。前者與富勒烯球籠受光誘導在氧存在時產生單線態氧等自由基有關，包括光激發的DNA斷裂、細胞膜損傷和細胞毒性等。不斷增加的研究資料顯示富勒烯衍生物在生物醫藥領域具有相當廣泛的應用前景，如作為光動力學治療中的光敏劑、抗衰老藥物、反義核酸藥物和藥物載體，其光敏作用的研究與應用逐漸成為富勒烯研究的前沿和熱門方向。越來越多的研究表明富勒烯量子產額高，比目前臨床應用的光敏劑效果好得多，且對正常皮膚、小鼠體重及血液中一些酶含量基本上沒有影響，為富勒烯作為腫瘤動力學治療中的光敏劑提供了理論依據；但也有不同的研究結論，還需要進一步深入系統地研究來證實。

不同的多肽具有不同的生物功能和用途，常用的功能肽有RGD肽、PHLATLF肽和TISWPPR肽等，短肽PHLATLF對卵巢癌A2780細胞具有生長抑制作用，TISWPPR這個七肽(TR-7)對大腸癌有特異性親和作用，主要是對腫瘤干細胞的特異性標記分子CD133有特異性的高親和作用，對腫瘤細胞的增殖能力及粘附能力沒有顯著影響，對腫瘤細胞的遷移運動能力有顯著的抑制作用。其中RGD肽是一類含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp）3個氨基酸的小分子多肽，可以與在某些腫瘤細胞高表達的整合素α_Vβ₃分子發生特異性結合，α_Vβ₃在正常組織系統極少表達甚至不表達，也使其成為腫瘤靶向治療理想的靶點。配體RGD與α_Vβ₃受體結合的特異性強，親和力高，是有效的藥物載體。

基于以上系列研究基礎，我們擬設計合成一種新型的富勒烯衍生物的納米光敏劑。為富勒烯修飾的RGD肽：FP（RGD），這樣一方面可以增加肽的穩定性及富勒烯的水溶性，充分發揮RGD肽的生物活性，從而獲得腫瘤靶向的光敏劑；另一方面，建立的實驗方法還可以用來連接不同的多肽（如抗體或表面受體），隨著功能肽的變換而獲得不同的生物學活性。富勒烯光動力學研究有不少報道，但合成的化合物結構復雜，很少有在生物學方面進一步系統的研究，對于這種富勒烯衍生物的納米顆粒的光敏性等抗腫瘤活性研究更是未見報道。

發明內容

本發明的目的是體供一種富勒烯單加成線肽的制備方法，大大提高了富勒烯在極性溶液中的溶解度，且具有良好的抗癌活性和清除自由基的能力。

為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：一種富勒烯單加成線肽，結構式如下：

其中L為RGD肽、TISWPPR?肽和PHLATLF?肽。

一種富勒烯單加成線肽的制備方法，包括以下步驟：

（1）N-取代富勒烯單加成吡咯烷與只有一個活性羧基的酸性氨基酸在二環己基碳二亞胺（DCC）、1-羥基苯并三唑（HOBT）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）的存在下，在氮氣保護下，用液相合成法進行縮合反應，室溫避光攪拌反應24~72小時，反應結束后，硅膠柱層析分離純化得到氨基和羧基均被保護的的富勒烯單加成氨基酸；

（2）氨基和羧基均被保護的的富勒烯單加成氨基酸加入三氟乙酸（TFA）/二氯甲烷（DCM）的混合溶液中，室溫攪拌反應0.5~12h，經脫保脫除羧基保護基得到僅含氨基保護基的富勒烯單加成氨基酸；

（3）將僅含氨基保護基的富勒烯單加成氨基酸溶于N,N二甲基甲酰胺（DMF）/DCM混合溶劑中，然后加入樹脂-多肽（僅有一個活性氨基，并且在端位）、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽（HBTU）、1-羥基苯并三唑（HOBT）和N,N-二異丙基乙胺（DIEA），在室溫下用固相合成法進行縮合反應，產物經脫保、裂解得到富勒烯單加成線肽；

以上各個步驟均在無水無氧的條件下進行；

所述步驟（1）中的只有一個活性羧基的酸性氨基酸為天冬氨酸或谷氨酸；

所述步驟（3）中的樹脂-線肽為樹脂-RGD肽、樹脂-TISWPPR?肽或樹脂-PHLATLF?肽。

所述步驟（1）中N-取代富勒烯單加成吡咯烷、只有一個活性羧基的酸性氨基酸、DCC、HOBt和DMAP的物質的量之比為0.05-0.2:2:2:2:0.2。