[發明專利]一種嗜熱鏈球菌的特異性分子標記DNA序列及其用途

在審

• 申請號: 201410838715.4
• 申請日: 2015-08-03
• 公開（公告）號: CN104498491A
• 公開（公告）日: 2015-07-29
• 發明（設計）人: 張紅發;任婧;郭本恒;劉振民
• 申請（專利權）人: 光明乳業股份有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68;C12Q1/14
• 代理公司: 上海弼興律師事務所 31283
• 代理人: 朱水平;沈利

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種嗜熱鏈球菌(Streptococcus?thermophilus)的特異性分子標記DNA序列及其用途。

背景技術

要對一種細菌進行分子水平的檢測需要獲知該細菌的特異性序列，而獲得一種細菌的特異性序列，往往需要對網上大量的已知序列進行分析比對；但有些細菌已測的序列較少，分析起來非常困難，難以得到其特異性序列。當然，也可以收集某一種細菌的所有菌株，進行測序比對，但該方法實驗時間較長、費用高昂。

嗜熱鏈球菌(Streptococcus?thermophilus)是益生菌的一種，廣泛應用于各種功能性食品中，尤其是在乳制品的開發研究中，日益受到重視。目前，在網上可以獲取的嗜熱鏈球菌已經經過測序的序列較少，因而難以分析得到嗜熱鏈球菌的特異性序列，這給嗜熱鏈球菌的分子檢測帶來不便。因此，有必要研究開發獲知嗜熱鏈球菌的特異性序列，以方便對其進行分子檢測。

發明內容

本發明所要解決的技術問題就是針對目前對嗜熱鏈球菌(Streptococcus?thermophilus)進行分子檢測不方便的現狀，而提供一種嗜熱鏈球菌的特異性分子標記DNA序列及其用途。本發明的嗜熱鏈球菌的特異性分子標記DNA序列與已經測過序的嗜熱鏈球菌的基因同源性大于99％，可以方便地用于對嗜熱鏈球菌進行分子檢測。此前，該分子標記未經報道過，是一個新發現的嗜熱鏈球菌的特異性序列。

本發明通過下述技術方案解決上述技術問題。

本發明提供的技術方案之一是：一種嗜熱鏈球菌(Streptococcus?thermophilus)的特異性分子標記DNA，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.6所示。

本發明提供的技術方案之二是：核苷酸序列組成如SEQ?ID?NO.6所示的嗜熱鏈球菌(Streptococcus?thermophilus)的特異性分子標記DNA在檢測嗜熱鏈球菌中的用途。

核苷酸序列組成如SEQ?ID?NO.6所示的嗜熱鏈球菌的特異性分子標記DNA，是嗜熱鏈球菌的種特異性序列，可以作為分子遺傳學標記，用于嗜熱鏈球菌的分子檢測。

本發明提供的技術方案之三是:一種嗜熱鏈球菌的檢測方法，其包括如下步驟：

(1)提取待測樣本的基因組DNA；

(2)以步驟(1)所得的基因組DNA為模板，以SEQ?ID?NO.1所示的半隨機引物為擴增引物進行單引物PCR擴增；

(3)對步驟(2)所得擴增產物進行克隆測序，并將測序結果與SEQ?ID?NO.6所示的核苷酸序列進行比對，若同源度大于99％，則表明待測樣本中含有嗜熱鏈球菌。

本發明中，步驟(1)為提取待測樣本的基因組DNA。所述的提取待測樣本的基因組DNA的方法為本領域常規，如可以采用液氮凍融-CTAB法，也可以采用溶菌酶法，還可以使用市售的各種基因組DNA提取試劑盒進行操作。

本發明中，步驟(2)為以步驟(1)所得的基因組DNA為模板，以SEQ?ID?NO.1所示的半隨機引物為擴增引物進行單引物PCR擴增。所述的單引物PCR擴增為本領域常規所指的含義，即擴增體系中只加入一條擴增引物進行DNA片段的合成。較佳地，所述的單引物PCR擴增的反應體系包括如下組分：0.5～2.0μmol/L半隨機引物，0.2～1.0mmol/L?dNTP，1.0～2.5mmol/L的Mg²⁺，0.02～0.10U/μLTaq?DNA聚合酶，以及0.5～2.0ng/μL基因組DNA模板。所述的單引物PCR擴增的反應程序包括：①93-96℃，4-6min；②93-96℃，20-40s；③45-58℃，20-40s；④70-72℃，30-120s；⑤70～72℃，5～10min；其中，步驟②至④的循環數為25-40。更佳地，所述的單引物PCR擴增的反應體系包括如下組分：1.0μmol/L半隨機引物，0.5mmol/L?dNTP，1.5mmol/L的Mg²⁺，0.05U/μLTaq?DNA聚合酶，以及1.0ng/μL基因組DNA模板。所述的單引物PCR擴增的反應程序包括：①95℃，5min；②95℃，30s；③50℃，30s；④72℃，2min；⑤72℃，5min；其中，步驟②至④的循環數為35。