[發明專利]一種基于ⅡB型限制性內切酶酶切的簡化基因組建庫方法

在審

• 申請號: 201410838513.X
• 申請日: 2014-12-26
• 公開（公告）號: CN104562214A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 孫子奎;高文學;丁方美;王鋒;唐嘉婕
• 申請（專利權）人: 上海派森諾生物科技有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06
• 代理公司: 上海晨皓知識產權代理事務所(普通合伙) 31260
• 代理人: 成麗杰

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，特別涉及一種基于ⅡB型限制性內切酶酶切的簡化基因組建庫方法。

背景技術

簡化基因組測序是一種對部分基因組進行序列測定的高通量測序方法。具體來說，它是指利用生物信息學方法，設計標記開發方案，富集特異性長度片段，然后應用高通量測序技術獲得海量標簽序列來代表目標物種全基因組信息的測序方法。

簡化基因組測序常用的測序文庫類型可以歸納為3個大類，①簡化測序，包括簡化文庫和簡化多態序列復雜性；②限制性酶切位點關聯DNA測序；③低覆蓋基因分型文庫，包括多元鳥槍法基因分型和基于測序的基因分型。

基于ⅡB型限制性內切酶酶切的簡化基因組測序，即2b-RAD，這個方法屬于簡化基因組測序方法中的限制性酶切位點關聯DNA測序這一類。相比于其他類的簡化基因組測序方法，2b-RAD在建庫方法上有了新的改進，且成本更加便宜。該方法能涵蓋基因組中的幾乎全部限制酶切位點，不同于RRLs、CroPS和GBS等方法，僅僅能覆蓋一個有限的區域，一般不超過500bp，所以可以更有效的進行PCR和測序。2b-RAD的操作方法比較簡單，因此更適合于大批樣本的同時分型。但是現有文獻中記載的2b-RAD方法大多存在酶切不均勻導致標簽數少，接頭連接效率低和文庫濃度低等不足之處。

發明內容

本發明的一個目的在于提供一種基于ⅡB型限制性內切酶酶切的簡化基因組建庫方法，該方法建庫流程簡便快捷，且建得文庫的準確性高。

為解決上述技術問題，本發明的實施方式提供了一種基于ⅡB型限制性內切酶酶切的簡化基因組建庫方法，包含下述步驟：(1)利用ⅡB型限制性內切酶對基因組DNA進行酶切，得到酶切產物；(2)對酶切產物連接接頭一和接頭二，得到連接產物；(3)對連接產物進行純化，得到純化后的連接產物；(4)將純化后的連接產物進行PCR擴增，得到PCR產物；(5)對PCR產物進行純化，得到測序文庫。其中，步驟(1)中所述的ⅡB型限制性內切酶為BsaXI酶；步驟(2)中所述的接頭一由序列如SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2所示的兩個核苷酸片段雜交合成、所述的接頭二由序列如SEQ?ID?NO：3和SEQ?ID?NO：2所示的兩個核苷酸片段雜交合成。

本發明的實施方式所提供的基于ⅡB型限制性內切酶酶切的簡化基因組建庫方法，采用BsaXI酶對基因組DNA進行酶切，在基因組DNA的靶標位點上游和下游位點切斷DNA,獲得長度一致的酶切產物DNA片段。然后，在酶切產物DNA片段的兩端再連接特異性接頭一和接頭二，其中接頭一由序列如SEQ?ID?NO：1(5ILL-NNN)和SEQ?ID?NO：2(anti-ILL)所示的兩個核苷酸片段雜交合成、接頭二由序列如SEQ?ID?NO：3(3ILL-NNN)和SEQ?ID?NO：2(anti-ILL)所示的兩個核苷酸片段雜交合成(在下述堿基序列中，N代表一個任意堿基，*N代表該堿基N硫代修飾)：

SEQ?ID?NO：1：5'-CTACACGACGCTCTTCCGATCTNN*N-3'

SEQ?ID?NO：2：5'-/5Phos/AGATCGGAAGAGC/3InvdT/-3'

SEQ?ID?NO：3：5'-CAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNN*N-3'

如上所示，在雜交合成接頭一或接頭二的核苷酸片段中，SEQ?ID?NO：1(5ILL-NNN)和SEQ?ID?NO：3(3ILL-NNN)在3’末端都有硫代修飾；而SEQ?ID?NO：2(anti-ILL)的3’末端的羥基去除，這樣可起到封閉作用，其目的是防止酶切后3’末端連續地加上多個接頭。在對酶切產物進行了接頭連接之后，本發明的實施方式增加了對連接產物進行純化的步驟(4)，以去除連接產物中的蛋白等雜質，防止這些雜質對后續PCR反應的影響。然后，本發明的實施方式對純化后的連接產物進行PCR擴增，對PCR產物進行純化，進而得到用于測序的文庫，該建得的測序文庫涵蓋基因組中的幾乎全部限制酶切位點，可以更有效地進行上機測序，且整個建庫過程的操作簡便快捷，建庫成本較低。