[發明專利]一種基于ⅡB型限制性內切酶酶切的簡化基因組建庫方法

在審

• 申請號: 201410838513.X
• 申請日: 2014-12-26
• 公開（公告）號: CN104562214A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 孫子奎;高文學;丁方美;王鋒;唐嘉婕
• 申請（專利權）人: 上海派森諾生物科技有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06
• 代理公司: 上海晨皓知識產權代理事務所(普通合伙) 31260
• 代理人: 成麗杰

1.一種基于ⅡB型限制性內切酶酶切的簡化基因組建庫方法，其特征在于，包含下述步驟：

(1)利用ⅡB型限制性內切酶對基因組DNA進行酶切，得到酶切產物；

(2)對酶切產物連接接頭一和接頭二，得到連接產物；

(3)對連接產物進行純化，得到純化后的連接產物；

(4)將純化后的連接產物進行PCR擴增，得到PCR產物；

(5)對PCR產物進行純化，得到測序文庫；

其中，步驟(1)中所述的ⅡB型限制性內切酶為BsaXI酶；步驟(2)中所述的接頭一由序列如SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2所示的兩個核苷酸片段雜交合成、所述的接頭二由序列如SEQ?ID?NO：3和SEQ?ID?NO：2所示的兩個核苷酸片段雜交合成。

2.根據權利要求1所述的基于ⅡB型限制性內切酶酶切的簡化基因組建庫方法，其特征在于，所述步驟(1)中的酶切在PCR儀中進行，PCR程序為：37℃，4小時。

3.根據權利要求1所述的基于ⅡB型限制性內切酶酶切的簡化基因組建庫方法，其特征在于，所述步驟(1)中對基因組DNA進行酶切時，BsaXI酶的用量為：每500ng基因組DNA使用1.25μL?BsaXI酶進行酶切。

4.根據權利要求1所述的基于ⅡB型限制性內切酶酶切的簡化基因組建庫方法，其特征在于，所述步驟(2)中，雜交合成接頭一或接頭二的PCR程序為：95℃，5分鐘，然后以0.1℃/秒的速度降至4℃。

5.根據權利要求1所述的基于ⅡB型限制性內切酶酶切的簡化基因組建庫方法，其特征在于，所述步驟(2)中，對酶切產物連接接頭一和接頭二所采用的反應體系如下所示：

酶切產物60μL，10×T4連接酶緩沖液10μL，10μM接頭一2μL，10μM接頭二2μL，T4DNA連接酶2μL，ddH₂O?24μL，總100μL，該連接反應在4℃下過夜進行。

6.根據權利要求1所述的基于ⅡB型限制性內切酶酶切的簡化基因組建庫方法，其特征在于，所述步驟(3)中采用磁珠法對連接產物進行純化。

7.根據權利要求1所述的基于ⅡB型限制性內切酶酶切的簡化基因組建庫方法，其特征在于，所述步驟(4)中對純化后的連接產物進行PCR擴增的反應體系如下所示：

高保真DNA聚合酶1μL，5×HF?Buffer?10μL，2.5mM?dNTP?6μL，10μM?SEQ?ID?NO：4所示的P5接頭引物1μL，10μM?SEQ?ID?NO：5所示的P7接頭引物1μL，10μM?SEQ?ID?NO：6所示的R2引物1μL，10μM帶條形碼序列的R1引物1μL，純化后的連接產物20μL，ddH₂O?9μL，總50μL。

8.根據權利要求7所述的基于ⅡB型限制性內切酶酶切的簡化基因組建庫方法，其特征在于，所述帶條形碼序列的R1引物的序列如SEQ?ID?NO：7、SEQ?ID?NO：8、SEQ?ID?NO：9或SEQ?ID?NO：10所示。

9.根據權利要求1所述的基于ⅡB型限制性內切酶酶切的簡化基因組建庫方法，其特征在于，所述步驟(4)中對純化后的連接產物進行PCR擴增的反應程序如下所示：98℃30秒；以98℃10秒、65℃30秒、72℃30秒為一個循環，進行12個循環；然后72℃5分鐘；最后4℃保存。

10.根據權利要求1所述的基于ⅡB型限制性內切酶酶切的簡化基因組建庫方法，其特征在于，所述步驟(5)中采用瓊脂糖凝膠電泳法對PCR產物進行純化。