[發明專利]一種葡萄糖醛酸轉移酶UGT1A1的特異性熒光探針及其應用

在審

• 申請號: 201410837037.X
• 申請日: 2014-12-29
• 公開（公告）號: CN104592986A
• 公開（公告）日: 2015-05-06
• 發明（設計）人: 崔京南;馮磊
• 申請（專利權）人: 大連理工常熟研究院有限公司
• 主分類號: C09K11/06
• 分類號: C09K11/06;C07D307/68;C12Q1/48;C12Q1/04
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種葡萄糖醛酸轉移酶UGT1A1的特異性熒光探針底物及其應用。

背景技術

葡萄糖醛酸轉移酶(Uridine?diphosphate-glucuronosyltransferase，UGT)超家族是機體內最重要的Ⅱ相藥物代謝酶，以SN2反應機制催化親脂性化合物與輔因子尿苷二磷酸葡糖醛酸(UDPGA)的葡萄糖醛酸(GA)結合，從而增加底物的親水性，使其能更有效地從尿或膽汁中排出體外。通常UGT酶介導的葡萄糖醛酸結合反應是機體的一個重要的解毒過程。許多內源性化合物，誘變劑，藥物，以及它們的代謝產物都是UGTs的底物，如內源性物質，如膽紅素和雌二醇，以及外源性物質SN-38和亞硝胺類化合物的脫毒都通過葡萄糖醛酸化途徑來實現。

人體的UGT酶可以分為4個家族：UGT1，UGT2，UGT3和UGT8。其中UGT1和UGT2家族各成員在內源性及外源性物質代謝中發揮了重要作用。目前，已被鑒定的人源UGT亞型有18個，其中包括UGT1A中的9個(UGT1A1，1A3，1A4，1A5，1A6，1A7，1A8，1A9，1A10)以及UGT2B中的7個亞型(UGT2B4，2B7，2B10，2B15和2B17)。值得注意的是，UGT1A1，1A4，1A6，1A9在人肝臟中都有中等程度的表達，但UGT1A3在人肝臟中表達量極低，同時UGT1A7，UGT1A8及UGT1A10僅在人腸道中表達。

UGT1A1是催化毒性內源性物質膽紅素葡萄糖醛酸化的酶，它介導的葡萄糖醛酸化反應是膽紅素排出體外的必須步驟，和人體健康的關系最為密切。已有國內外大量研究證實UGT1A1的基因突變使得膽紅素葡萄糖醛酸化的能力全部或部分的缺失進而影響膽紅素的代謝，從而導致嚴重的高膽紅素血癥如Crigler-Najjar綜合癥和Gilbert's綜合癥(Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.2000.40:581-616)。同時UGT1A1也是多種臨床藥物，如Etoposide、SN-38(抗癌藥物伊立替康的活性代謝產物)的主要代謝酶，且UGT1A1的活性缺失已被證實和伊立替康的毒性相關(J.Clin.Oncol.2006.24:4534-8)。因此，開展UGT1A1酶活性的個體差異研究對于臨床個性化安全用藥有著重要意義。此外，部分臨床藥物會抑制UGT1A1，從而減少機體對膽紅素的代謝清除能力，引起血液中膽紅素的上升，進而導致高膽紅素血癥或加劇Crigler-Najjar綜合癥和Gilbert's綜合癥患者的病情。目前國內外制藥巨頭在藥物開發過程中，需要在體外評估各候選新藥抑制UGT1A1的能力。因此，開發高效、靈敏的特異性UGT1A1探針底物對于高效篩選UGT1A1抑制劑，及定量測定生物體系內UGT1A1的活性至關重要。

由于UGT1A亞家族中的各亞型具有相似的氨基酸序列，其底物通常相互交疊，各亞型酶鮮有特異性的底物。目前，已報道的UGT1A1的探針底物有3個，分別是膽紅素、雌二醇和依托泊甙。雖然膽紅素的單酶選擇性較高，但其化學穩定性差、檢測靈敏度低。而雌二醇和依托泊甙的單酶選擇性并不高且需借助LC-MS/MS等昂貴分析儀器才能實現產物的定量分析。因此，開發選擇性高的UGT1A1的特異性熒光探針底物及其配套的高通量檢測方法具有重要的實用價值。

發明內容

本發明的目的在于提供一種葡萄糖醛酸轉移酶UGT1A1的特異性熒光探針及其應用，該特異性熒光探針底物和葡萄糖醛酸化產物的熒光屬性有明顯差異。利用該探針反應可對多種生物體系中UGT1A1的分布和功能進行定量評價。

本發明提供了一種葡萄糖醛酸轉移酶UGT1A1的特異性熒光探針底物，該底物為(E)-2-(4-(4-羥基苯乙烯基)-3-氰基-5,5-二甲基呋喃-2(5H)-亞基)丙二腈，簡寫為TCF。

本發明還提供了所述葡萄糖醛酸轉移酶UGT1A1的特異性熒光探針底物的應用，采用上述式(1)化合物作為UGT1A1亞酶的特異性底物，進行葡萄糖醛酸化結合反應，通過定量檢測單位時間內的底物消除率或其葡萄糖醛酸化產物的生成率來定量測定不同生物體系(包括重組表達UGT1A1單酶、人或動物組織制備液、各類組織細胞等生物體系)中UGT1A1的活性；具體測定方法為：

——體系中以TCF作為特異性探針底物；底物濃度選擇1/10～10K_m；單點測定時底物濃度優選K_m。