[發(fā)明專利]雞mtDNA Cytb基因全序列的擴(kuò)增及測(cè)序方法和專用引物

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410835923.9
• 申請(qǐng)日: 2014-12-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104611327A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-05-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高玉時(shí);賈曉旭;唐修君;陸俊賢;唐夢(mèng)君;張靜;馬麗娜;樊艷鳳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇省家禽科學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 揚(yáng)州蘇中專利事務(wù)所(普通合伙) 32222
• 代理人: 王玉霞

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種雞mtDNA?Cytb基因全序列擴(kuò)增及其測(cè)序方法。

背景技術(shù)

動(dòng)物遺傳資源多樣性能夠?yàn)槠贩N改良提供素材，并且能夠很好適應(yīng)環(huán)境的變化。我國(guó)有豐富家禽地方品種資源，研究和評(píng)估我國(guó)家禽地方品種的遺傳多樣性，制定合理的利用和保護(hù)措施對(duì)我國(guó)畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。研究動(dòng)物遺傳多樣性的方法主要有微衛(wèi)星和線粒體DNA等，兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，線粒體DNA更容易操作。畜(禽)品種大都受到外來(lái)公畜(禽)雜交改良的影響，群體數(shù)量減少甚至消失，給研究品種起源和多樣性帶來(lái)很大困難。線粒體DNA在遺傳過(guò)程中，遺傳物質(zhì)通過(guò)卵細(xì)胞質(zhì)傳遞，較少發(fā)生DNA重組，其野生祖先的線粒體DNA類型一般能得以保持。這種遺傳方式，一個(gè)個(gè)體就能代表一個(gè)母性集團(tuán)，因此只需少量個(gè)體樣本便能反映一個(gè)群體的遺傳結(jié)構(gòu)。研究者可以從復(fù)雜的遺傳背景中分辨不連續(xù)的母系血統(tǒng)，即使經(jīng)過(guò)幾千年的雜交繁育，系統(tǒng)關(guān)系依然明晰。

雞線粒體基因組一般在16785bp左右，為閉合環(huán)狀雙鏈結(jié)構(gòu)，能夠自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。包括37個(gè)基因的編碼編碼區(qū)(13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、2個(gè)核糖體RNA基因、22個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因)和1個(gè)控制區(qū)。細(xì)胞色素b(Cyt?b)基因是mt?DNA?13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中結(jié)構(gòu)和功能了解的最為清楚的一個(gè)，也是編碼蛋白質(zhì)唯一位于線粒體基區(qū)的。細(xì)胞色素b(Cyt?b)基因進(jìn)化速率適中，從科間到種間，乃至種內(nèi)具有豐富的多態(tài)性，是研究種間和種內(nèi)遺傳分化程度及系統(tǒng)進(jìn)化的理想的分子標(biāo)記。Cyt?b基因部分或者全部序列已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于動(dòng)物類群的遺傳多樣和系統(tǒng)進(jìn)化研究中，全序列包含的遺傳信息更為豐富。由于Cyt?b基因下游為tRNA-Thr基因(69bp)、tRNA-Pro基因(70bp)，折疊成三葉草形的短鏈，較正常的核苷酸結(jié)構(gòu)測(cè)序困難，一般反向測(cè)序都難以成功。目前還沒(méi)有運(yùn)用Cyt?b基因全序列對(duì)我國(guó)家禽地方品種進(jìn)行系統(tǒng)的研究，因此建立Cyt?b基因全序列擴(kuò)增和測(cè)序方法是十分必要的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提出一種雞mtDNA?Cytb基因全序列的擴(kuò)增及測(cè)序方法和專用引物，本發(fā)明速度快、成本低、易于掌握，能夠有效檢測(cè)出雞的mtDNA?Cytb基因全序列。

本發(fā)明提供了一種雞mtDNA?Cytb基因全序列的擴(kuò)增及測(cè)序用引物，包括PCR引物和測(cè)序引物，所述PCR引物的上游引物為：5'-TCTTACCTGGGTTCTTTCG-3'，PCR引物的下游引物為：5'-TTTAGTGGAGTTGCGGTGT-3'；

所述測(cè)序引物為Walking?primer：5'-CGCCTTTGTGGGCTATGTT-3'。

本發(fā)明還提供了一種雞mtDNA?Cytb基因全序列擴(kuò)增及其測(cè)序方法，包括以下步驟：

(1)提取雞羽毛中的DNA，并檢測(cè)質(zhì)量；

(2)根據(jù)紅色原雞mtDNA?Cytb基因在mtDNA全基因組序列上的相對(duì)位置，在mtDNA?Cytb基因上下游保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，引物序列為：

Forward?prime(SEQ?ID?NO.1):5'-TCTTACCTGGGTTCTTTCG-3'

Reverse?primer(SEQ?ID?NO.2):5'-TTTAGTGGAGTTGCGGTGT-3'

(3)PCR產(chǎn)物測(cè)序與序列拼接

通過(guò)PCR反應(yīng)，獲得目的片段，純化后送測(cè)序公司測(cè)序，由于mtDNA?Cytb基因下游結(jié)構(gòu)復(fù)雜，反向引物無(wú)法測(cè)出，根據(jù)正向引物已測(cè)出的mtDNA?Cytb基因序列設(shè)計(jì)一條測(cè)序引物，進(jìn)行引物步移(Primer?walking)測(cè)序，讓后將正向引物和步移引物測(cè)得兩條序列進(jìn)行拼接，獲得mtDNA?Cytb基因全序列。

Walking?primer(SEQ?ID?NO.3)5'-CGCCTTTGTGGGCTATGTT-3'