[發(fā)明專利]雞mtDNA Cytb基因全序列的擴(kuò)增及測序方法和專用引物

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410835923.9
• 申請日: 2014-12-29
• 公開（公告）號: CN104611327A
• 公開（公告）日: 2015-05-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 高玉時;賈曉旭;唐修君;陸俊賢;唐夢君;張靜;馬麗娜;樊艷鳳
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇省家禽科學(xué)研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 揚(yáng)州蘇中專利事務(wù)所(普通合伙) 32222
• 代理人: 王玉霞

1.雞mtDNA?Cytb基因全序列的擴(kuò)增及測序用引物，其特征在于，包括PCR引物和測序引物，所述PCR引物的上游引物為：5'-TCTTACCTGGGTTCTTTCG-3'，PCR引物的下游引物為：5'-TTTAGTGGAGTTGCGGTGT-3'；

所述測序引物為Walking?primer：5'-CGCCTTTGTGGGCTATGTT-3'。

2.一種雞mtDNA?Cytb基因全序列的擴(kuò)增及測序方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取雞羽毛中的DNA，并檢測質(zhì)量；

(2)在雞mtDNA?Cyt?b基因上下游保守區(qū)域設(shè)計一對權(quán)利要求1所述的PCR引物，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增包含Cytb基因的片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測；

(3)利用權(quán)利要求1所述的測序引物對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序；

(4)對測序獲得序列進(jìn)行拼接，并減掉上下游多余的序列，獲得雞mtDNA?Cyt?b基因全序列，雞mtDNA?Cyt?b基因全長為1143bp。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雞mtDNA?Cytb基因全序列的擴(kuò)增及其測序方法，其特征在于，所述用于擴(kuò)增雞mtDNA?Cyt?b基因全序列的PCR反應(yīng)體系為：PCR?Mix?25μL，10μmol/LPCR引物上、下游引物各1.5μL，模板2μL，滅菌水20μL。

4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的雞mtDNA?Cytb基因全序列的擴(kuò)增及其測序方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)條件為：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃60s，30個循環(huán)；72℃4min。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雞mtDNA?Cytb基因全序列的擴(kuò)增及其測序方法，其特征在于，所述提取雞羽毛中的DNA步驟為：所述羽毛樣采集雛雞或者成雞換羽后剛長出的羽毛2-3根，剪掉羽根上部的絨羽，羽毛剪碎后放入2mL離心管中，每個樣品加入裂解液1000μL及蛋白酶K?40μL搖勻，放搖床內(nèi)59℃水浴消化；消化充分后，加700-800uL飽和酚，搖勻10min后以轉(zhuǎn)速10000rpm離心5min；

吸取上清液放入2mL離心管中，加1000uL飽和酚，搖勻5min后以轉(zhuǎn)速10000rpm離心5min；

吸取上清液放入2mL離心管中，加氯仿1000uL，搖勻5min后以轉(zhuǎn)速10000rpm離心5min；

吸取上清液放入2mL離心管中，加無水乙醇沉淀出DNA團(tuán)塊，留下DNA倒掉乙醇，再把DNA團(tuán)塊用70％的酒精洗一遍，以轉(zhuǎn)速10000rpm離心10min；倒掉乙醇，留下DNA，涼干1h，加滅菌水100uL溶解，放-20℃冰箱保存。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雞mtDNA?Cytb基因全序列的擴(kuò)增及其測序方法，其特征在于，步驟(4)中所述對測序獲得序列進(jìn)行拼接步驟為：將步驟3所述測序獲得序列用DNAStar5.02軟件的SeqMan程序拼接，將拼接序列與GenBank中紅色原雞參考序列NC_007235進(jìn)行比對，剪掉引物及多余的序列，獲得雞mtDNA?Cytb基因全長。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雞mtDNA?Cytb基因全序列的擴(kuò)增及其測序方法，其特征是，測序獲得包含mtDNA?Cytb基因全長及上游和下游部分序列的1490bp的特異性擴(kuò)增條帶的核苷酸序列為：

TCTTACCTGG?GTTCTTTCGC?CCTCACAATC?CTTACAACGA?TCCTACTTAT?CCAAAAATAA?60?ACTAatggca?cccaacattc?gaaaatccca?ccccctacta?aaaataatta?acaactccct?120?aatcgacctc?ccagccccat?ccaacatctc?tgcttgatga?aatttcggct?ccctattagc?180?agtctgcctc?atgacccaaa?tcctcaccgg?cctactacta?gccatgcact?acacagcaga?240?cacatcccta?gccttctcct?ccgtagccca?cacttgccgg?aacgtacaat?acggctgact?300?catccggaat?ctccacgcaa?acggcgcctc?attcttcttc?atctgtatct?tccttcacat?360?cggacgaggc?ctatactacg?gctcctacct?ctacaaagaa?acctgaaaca?caggagtaat?420?cctcctcctc?acactcatag?ccaccgcctt?tgtgggctat?gttctcccat?ggggccaaat?480?atcattctga?ggggccaccg?ttatcacaaa?cctattctca?gcaattccct?acattggaca?540?caccctagta?gagtgagcct?gaggaggatt?ctcagtcgac?aacccaaccc?ttacccgatt?600?cttcgcctta?cacttcctcc?tcccctttgc?aatcgcaggt?attactatca?tccacctcac?660?cttcctacac?gaatcaggct?caaacaaccc?cctaggcatc?tcatccgact?ctgacaaaat?720?tccatttcac?ccatactact?ccttcaaaga?cattctgggc?ttaactctca?tactcacccc?780?attcctaaca?ctagccctat?tctcccccaa?cctcctagga?gacccagaaa?acttcacccc?840?agcaaaccca?ctagtaaccc?ccccacatat?caaaccagaa?tgatattttc?tattcgccta?900?tgccatccta?cgctccatcc?ccaacaaact?tggaggtgta?ctagccctag?cagcctcagt?960?cctcatcctc?ttcctaatcc?ccttcctcca?caaatctaaa?caacgaacaa?taaccttccg?1020?accactctcc?caaaccctat?tctgacttct?agtagccaac?cttcttatcc?taacctgaat?1080?cggaagccaa?ccagtagaac?accccttcat?catcattggc?caaatagcat?ccctctctta?1140?cttcaccatc?ctacttatcc?tcttccccac?aatcggaaca?ctagaaaaca?aaatactcaa?1200?ctactaaAAT?ACTCTAATAG?TTTATGAAAA?ACATTGGTCT?TGTAAACCAA?AAACTGAAGA?1260?CTCCACCCTT?CTTAGAGTAT?CAGAAAAGGA?GGACTCAAAC?CTCCATCTCC?AGCTCCCAAA?1320?GCTGGTATTT?TCAAATAAAC?TACTCTCTGA?AACCCTTAAA?CCGCCCGAAT?TGCCCCCCGA?1380?GACAACCCAC?GCACAAGCTC?TAGTACAACA?AACAAAGCTA?ACAACAAACC?TCACCCAGCC?1440?ACCAAAAACA?ACCCAACCCC?ACATGAATAA?AACACCGCAA?CTCCACTAAA?1490。