[發明專利]一種用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌的核苷酸序列及檢測方法與檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201410833123.3
• 申請日: 2014-12-29
• 公開（公告）號: CN104450940A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 陸兆新;陶婷婷;別小妹;呂鳳霞;張充;趙海珍
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀昌;唐循文

技術領域

本發明涉及的是食源性致病菌檢測技術領域，是一種用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria?monocytogenes，簡稱單增李斯特菌)的核苷酸序列及檢測方法與檢測試劑盒。

背景技術

單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria?monocytogenes,LM)是一種人畜共患病的病原菌，屬于李斯特菌屬(Listeria?spp.)，在自然界中的廣泛存在，當牲畜感染后，通過食物鏈最后導致人類的感染。據WHO報道，健康人的糞便中單增李斯特菌攜帶率為0.6％～16％，有70％的人可短期帶菌。人類受感染后可導致胃腸炎、敗血癥、腦膜炎、流產等疾病，其中孕婦、嬰兒、老年人及免疫力低下者為易感人群，人類感染單增李斯特菌后有高達20％～30％的致死率。因此，2002年WHO將單增李斯特菌列為僅次于大腸桿菌O157、沙門氏菌、志賀氏菌后的第四大重要的食源性致病菌。單增李斯特在4℃的環境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。國際國內食品標準規定食品中致病菌不得檢出，為有效控制原菌的發生和擴散，有效控制和預防食品中單增李斯特菌污染至關重要。

目前，單增李斯特菌的檢測方法以傳統的鑒別培養為基礎，通過分離培養、生化反應、溶血試驗、動物試驗等進行分離鑒定。實驗設備要求不高，可操作性強，但檢驗周期長，需6-7d。一些快速單增李斯特菌檢測方法除了ELISA法應用于實際檢測外，分子生物學方法大多數處于科學研究階段，尚未廣泛應用。因此單增李斯特菌急需特異性和敏感度高的快速診斷方法。

發明內容

本發明的目的在于為了克服以上現有技術的不足而提供一種用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌的核苷酸序列及檢測方法與檢測試劑盒；檢測試劑盒具有特異性好、靈敏度高、檢測時間短的單核細胞增生李斯特氏菌的特點，提高其檢測效率和精確度。

技術方案

一種用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌的核苷酸序列，包括1623bp，序列為SEQ?ID?NO.1所示。

一種檢測檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法，包括以下步驟：

(1)提取待測樣品的基因組DNA；

(2)以步驟(1)所提取的基因組DNA為模板，與特異性引物Lm16、PCR緩沖液、MgCl₂溶液、脫氧三磷酸核苷混合物和Taq-DNA聚合酶混合配置PCR反應體系，進行PCR反應；

其中特異性引物Lm16為Lm16F：5’-CTGTTCGTCGGTCCGTGGTA-3’，

????????????????????Lm16R：5’-CAATGCTCTAATGCGGTGGT-3’；

(3)檢測PCR產物是否為權利要求1所述的大小為1623bp的單一擴增產物。

以上檢測方法的步驟(1)中，提取基因組DNA的方法為分子生物學領域常用方法，各種市售細菌基因組DNA提取試劑盒均可實現相同提取目的。

在本發明種擴增產物的判定原則為PCR反應之后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，若步驟(2)所得PCR反應擴增產物在1623bp位置有對應產物，則判定結果為陽性，若所得PCR產物無擴增條帶或在1623bp位置無對應產物，則判定結果為陰性。

進一步地，以上所述的檢測檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法，步驟(2)中PCR反應體系包括10×PCR?buffer，5.0～10.0mM?MgCl₂，1.0～2.0mM?dNTP，10～20μM引物Lm16F，10～20μM引物Lm16R，1～10ng/μL基因組DNA，0.5～1U?Taq?DNA聚合酶，雙蒸水補齊至25μL；PCR反應過程為：①94℃，3min；②94℃，30s；③60℃，30s；④72℃，75s；步驟②至④循環35次；⑤72℃，10min；⑥4℃保存。

進一步地，以上所述的檢測檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法，步驟(3)中PCR反應產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測。

一種用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌的檢測試劑盒，包括特異性引物Lm16、PCR緩沖液、MgCl₂溶液、脫氧三磷酸核苷混合物和Taq-DNA聚合酶，所述特異性引物Lm16序列如下：

上游引物Lm16F：5’-CTGTTCGTCGGTCCGTGGTA-3’

下游引物Lm16R：5’-CAATGCTCTAATGCGGTGGT-3’。