[發(fā)明專利]一種用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌的核苷酸序列及檢測方法與檢測試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410833123.3
• 申請日: 2014-12-29
• 公開（公告）號: CN104450940A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陸兆新;陶婷婷;別小妹;呂鳳霞;張充;趙海珍
• 申請（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀昌;唐循文

1.一種用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌的核苷酸序列，其特征在于，包括1623bp，序列為SEQ?ID?NO.1所示。

2.一種檢測檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）提取待測樣品的基因組DNA；

（2）以步驟（1）所提取的基因組DNA為模板，與特異性引物L(fēng)m16、PCR緩沖液、MgCl₂溶液、脫氧三磷酸核苷混合物和Taq-DNA聚合酶混合配置PCR反應(yīng)體系，進行PCR反應(yīng)；其中特異性引物L(fēng)m16為Lm16F：5’-CTGTTCGTCGGTCCGTGGTA-3’，

Lm16R：5’-CAATGCTCTAATGCGGTGGT-3’；

（3）檢測PCR產(chǎn)物是否為權(quán)利要求1所述的大小為1623bp的單一擴增產(chǎn)物。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于，步驟（2）中PCR反應(yīng)體系包括10×PCR?buffer，5.0~10.0mM?MgCl₂，1.0~2.0mM?dNTP，10~20μM引物L(fēng)m16F，10~20μM引物L(fēng)m16R，1~10ng/μL?基因組DNA，0.5~1U?Taq?DNA聚合酶，雙蒸水補齊至25μL；PCR反應(yīng)過程為：①94℃，3min；②94℃，30s；③60℃，30s；④72℃，75s；步驟②至④循環(huán)35次；⑤72℃，10min；⑥4℃保存。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于，步驟（3）中PCR反應(yīng)產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測。

5.一種用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌的檢測試劑盒，其特征在于，包括特異性引物L(fēng)m16、PCR緩沖液、MgCl₂溶液、脫氧三磷酸核苷混合物和Taq-DNA聚合酶，所述特異性引物L(fēng)m16序列如下：

上游引物L(fēng)m16F：5’-CTGTTCGTCGGTCCGTGGTA-3’

下游引物L(fēng)m16R：5’-CAATGCTCTAATGCGGTGGT-3’。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括含有權(quán)利要求1所述的核苷酸序列的單增李斯特氏菌標準菌株的DNA標準品。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌的檢測試劑盒，其特征在于，PCR緩沖液為10×PCR?buffer，MgCl₂溶液濃度為5.0~10.0mM，脫氧三磷酸核苷混合物濃度為1.0~2.0mM，引物L(fēng)m16F濃度為10~20μM，引物L(fēng)m16R濃度為10~20μM，TaqDNA聚合酶活為0.5~1U。