[發明專利]SelK基因表達水平的熒光定量PCR檢測試劑盒及方法

有效

• 申請號: 201410830420.2
• 申請日: 2014-12-26
• 公開（公告）號: CN104561288A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 張仁利;李瑞敏
• 申請（專利權）人: 深圳市疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 深圳中一專利商標事務所 44237
• 代理人: 張全文

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種SelK基因表達水平的熒光定量PCR檢測試劑盒及方法。

背景技術

硒是一種人類和動物必需的微量元素，與許多疾病密切相關，如癌癥、神經退行性疾病及心血管病等，并在一些重大疾病的防治中起到重要作用。

在現有已發現的25種硒蛋白中，硒蛋白K(SelK)是2003年被Gladyshv實驗室鑒定出的一種新型硒蛋白；SelK是一個含有94個核苷酸，大小為10.6KD的小分子蛋白。關于SelK的生物學功能尚不明確，近幾年發現SelK可能有如下功能：SelK在心肌細胞中參與應對氧化應激；在人肝癌細胞中參與調節內質網應激；在受體介導的免疫細胞活化過程中促進鈣流；參與內質網相關蛋白降解；參與調節巨噬細胞表面CD36棕櫚酰化；影響泡沫細胞的形成和動脈粥樣化等。因此硒蛋白K的表達水平對于多種生命活動中的癥狀診斷具有非常重要的參考價值。

而現有對于SelK表達水平的檢測方法中，多通過傳統的蛋白質染色印跡或者熒光定量PCR的方法進行。其中，熒光定量PCR可以快速實時的監測并計算模版的初始濃度，為研究蛋白在轉錄水平上的表達提供了便捷的一種方法。而現有的熒光定量PCR中的染料法是屬于非特異性的檢測方法，不如熒光探針法對模版沒有特異性；同時，現有熒光探針法的引物和探針多只適用于某一特定的局部組織或者細胞，在其他的組織細胞檢測中經常擴增不到目的條帶，使用中存在不足。

發明內容

本發明實施例的目的在于克服現有技術的上述不足，提供一種適用于各種人的細胞或組織鑒定SelK基因表達水平的熒光定量PCR檢測試劑盒及方法。

為了實現上述發明目的，本發明實施例的技術方案如下：

一種SelK基因表達水平的熒光定量PCR檢測試劑盒，包括特異性引物和熒光探針；其中，

所述特異性引物包括具有序列表SEQ.ID.No.1堿基序列的上游引物F和具有序列表SEQ.ID.No.2堿基序列的下游引物R；

所述熒光探針具有序列表SEQ.ID.No.3堿基序列，且5’端標記有可淬滅的報告基團，3’標記有BHQ熒光基團。

采用本專利中的引物探針可以成功擴增出目的基因，擴增曲線良好，電泳結果顯示目的條帶清晰；且引物探針反應性能良好，適用于各種人的細胞或組織鑒定SelK的表達。

本發明進一步還提出一種采用上述試劑盒進行SelK基因表達水平的熒光定量PCR檢測方法，包括如下步驟：

提取待測樣本RNA；

將所述待測樣本RNA進行反轉錄，得到反轉錄DNA；

以所述反轉錄DNA為模板，進行實時熒光PCR；

檢測PCR過程中的熒光信號；

其中，所述實時熒光PCR過程中采用的引物包括具有序列表SEQ.ID.No.1堿基序列的上游引物F和具有序列表SEQ.ID.No.2堿基序列的下游引物R；

所述實時熒光PCR過程中采用的熒光探針具有序列表SEQ.ID.No.3堿基序列，且5’端標記有可淬滅的報告基團，3’標記有BHQ熒光基團。

本發明的上述檢測方法，實時反映靶基因擴增的過程，并根據內參或外參直接反映出靶基因的拷貝數；具有靈敏度高、特異性強等優點；并且引物和探針基于硒蛋白表達的mRNA的特定的區域設計，適用于各種人的細胞或組織鑒定SelK的表達。

附圖說明

下面將結合附圖及實施例對本發明作進一步說明，附圖中：

圖1為本發明實施例SelK基因表達水平的熒光定量PCR檢測的熒光變化圖；

圖2為本發明實施例SelK基因表達水平的熒光定量PCR擴增產物的電泳結果圖；

圖3為圖1中熒光熒光曲線對應的擴增樣本和統計數據圖。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

本發明實施例提供一種SelK基因表達水平的熒光定量PCR檢測方法，包括如下步驟：

S10，獲取待測樣本，并提取待測樣本的RNA；

S20，以提取的待測樣本的RNA模板進行實時熒光RT-PCR；

S30，RT-PCR過程中的熒光信號。