[發明專利]一種磁珠法提取細菌中核酸的試劑盒及提取方法

無效

• 申請號: 201410828555.5
• 申請日: 2014-12-26
• 公開（公告）號: CN104450684A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 王煒;孟慶海;李智洋;何農躍;曲文靜
• 申請（專利權）人: 南京中科神光科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司 11429
• 代理人: 張曉霞

技術領域

本發明涉及核酸提取的生物技術領域，特別是一種基于磁珠法提取細菌中核酸的試劑盒。本發明還涉及使用磁珠法提取細菌中核酸的方法。

背景技術

聚合酶鏈式反應(Polymerase?Chain?Reaction,PCR)技術自80年代面世以來，越來越多的應用于分子生物學領域，核酸的分子生物學技術是進行病原微生物檢測，構建基因庫，物種起源、多樣性評估及其親緣關系、系統進化等常用研究手段之一。但核酸的提取是PCR技術應用的前提，且能否提取出高質量的核酸分子是許多核酸分子生物學試驗中的關鍵，提取方法的靈敏度、特異性也將直接關系到后續試驗的成敗。堿裂解提取法到柱純化等提取技術，目前廣泛地用于細菌的DNA和RNA的提取，但這些方法還是存在諸多缺點，如耗時長、效率低，并且由于采用苯酚等毒性有機溶劑，操作有一定的風險性。

相比上述核酸提取技術，磁性分離法是一種簡單有效的核酸提純方法。該方法使用的磁珠表面連接了可特異地與DNA發生作用的功能基團，具有可逆吸附DNA的特性。磁珠法提純核酸最大的優點是自動化，以及提供的試劑可用于磁性工具，該種方法不需要任何有機溶劑，也不需要反復離心，真空過濾或柱分離等步驟，僅僅是以核酸結合磁粉為基礎，大大減少了試驗對工作人員的危害，以及降低了對試驗設備的特殊要求。磁珠法所用試劑種類與濃度等參數的選擇決定了提取核酸的質量與效率，也與成本密切相關，因此不斷探索更為便捷和高效的提取工具和提取方法，對核酸提取相關的基因工程的各項研究具有重大的意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種新的細菌核酸快速提取的試劑盒及提取核酸的方法，該試劑盒具有操作簡單快速、使用安全、提取效率高、制造成本低的特點。應用該試劑盒及方法，可以對用于PCR技術檢測的生物學中的多種細菌中的核酸實現快速提取。

本發明的技術方案為：

一種磁珠法提取細菌中核酸的試劑盒，包含組分為：細菌裂解液、磁珠結合液、磁珠洗滌液和核酸洗脫液。所述細菌裂解液含有十二烷基硫酸鈉、乙二胺四乙酸、三羥甲基氨基甲烷和氯化鈉；所述磁珠結合液含有聚乙二醇-8000和氯化鈉；所述磁珠洗滌液含有乙醇；所述核酸洗脫液含有羥甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸；

優選的，所述磁珠結合液中，聚乙二醇-8000的濃度為20-30mmol/L，氯化鈉的濃度為3mol/L；

優選的，所述磁珠洗滌液中，乙醇的體積比濃度為70％-90％；

優選的，所述核酸洗脫液中，三羥甲基氨基甲烷的濃度為為5-15mmol/L，所述乙二胺四乙酸的濃度為1.30-1.50mmol/L；

進一步優選的，所述三羥甲基氨基甲烷的濃度為10mmol/L，所述乙二胺四乙酸的濃度為1.35mmol/L；

優選的，在所述細菌裂解液中，十二烷基硫酸鈉的濃度為40-60mmol/L，所述乙二胺四乙酸的濃度為20-40mmol/L，所述三羥甲基氨基甲烷的濃度為90-115mmol/L，所述氯化鈉的濃度為480-520mmol/L，余量為無菌水；所述細菌裂解液通過加入氫氧化鈉調節pH值至7.5-8.5。

一種磁珠法提取細菌中核酸的提取方法，包括以下步驟：

步驟1：將細菌及培養液混合物離心分離，去上清除去細胞培養液，留下細菌菌體；離心分離的轉速為13000r/min，離心分離的時間為2分鐘；

步驟2：向菌體中加入細菌裂解液，混勻；

步驟3：加入磁珠及磁珠結合液，磁鐵吸附去上清；

步驟4：加入磁珠洗滌液，使用磁鐵吸附磁珠，去上清；

步驟5：加入核酸洗脫液，使用磁鐵吸附磁珠，轉移洗脫液，得到細菌的核酸溶液。

優選的，上述步驟2中加入的細菌裂解液的體積與細菌培養液的體積比為1:1-1:5，步驟3中加入的磁珠與磁珠結合液與細菌裂解液的體積比為1:10-1:20，步驟4中磁珠洗滌液與細菌裂解液的體積比為1:0.1-1:0.5，步驟5中核酸洗脫液與細菌裂解液的體積比為1：10-1:20。

一種磁珠法提取細菌中核酸的提取方法，包括以下步驟：

步驟1：將細菌及培養液混合物離心分離，去上清除去細胞培養液，留下細菌菌體；離心分離的轉速為13000r/min，離心分離的時間為2分鐘；

步驟2：向菌體中加入細菌裂解液，混勻后，轉移至96孔反應板的1排和7排；在2排和8排加入磁珠及磁珠結合液；在3排、4排、5排和9排、10排、11排加入磁珠洗滌液；在6排和12排加入核酸洗脫液；