[發明專利]一種豬藍耳病卵黃抗體的制備方法

有效

• 申請號: 201410827855.1
• 申請日: 2014-12-25
• 公開（公告）號: CN104558165B
• 公開（公告）日: 2018-05-18
• 發明（設計）人: 蔣春茂;陳曉蘭;武彩紅;賈紀萍;楊海峰;管遠紅;王妲妲;陳毓;周芳
• 申請（專利權）人: 江蘇農牧科技職業學院;蔣春茂
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C07K16/02
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 龔擁軍

本發明公開了一種高效價豬藍耳病卵黃抗體的制備方法，屬于抗體制備技術領域。本發明中高效價豬藍耳病卵黃抗體的制備方法，通過采用目前已有的免疫豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗免疫蛋雞，在免疫過程中通過喂食桑葉杜仲提取物；通過收集2～6周的免疫PRRS疫苗的雞蛋，提取卵黃水提液，對卵黃水提液采用凍融法純化獲得卵黃抗體IgY。本發明制備方法中的桑葉杜仲提取物通過喂食的方法能夠明顯提高機體免疫功能，促進抗體產生，符合當前綠色食品的需求，本研究選擇桑葉杜仲提取物作為免疫增強劑以制備高效價藍耳病卵黃抗體，對豬藍耳病的緊急治療具有實用價值，從而對減少養豬業的經濟損失，促進新型獸用生物藥物開發具有重要意義。

技術領域

本發明屬于抗體制備技術領域，特別涉及一種豬藍耳病卵黃抗體的制備方法。

背景技術

豬藍耳?。╬orcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是我國豬病中最主要的一種免疫抑制病，主要引起大量懷孕母豬流產、早產，產下死胎等，給養豬業帶來嚴重的經濟損失。像其他傳染病一樣，豬藍耳病的主要預防手段是接種疫苗，但是在實踐過程中，藍耳病疫苗防治經常會出現免疫失敗，其主要原因是疫苗免疫時，機體產生中和抗體時間較長，或不能產生高效價的抗體，如高致性藍耳病滅活苗需要14天才能產生，20天才能達到有效保護，而在此期間均有可能感染。因此，采用人工主動與被動聯合免疫防治豬藍耳病具有重要意義。

針對目前畜禽重大疾病尤其是病毒性疾病的防治中無特效藥物，利用卵黃抗體（Egg Yolk Immunoglobulin，IgY）對畜禽進行被動免疫來防治畜禽傳染病是一種很好的措施。卵黃抗體是通過對禽類（雞）免疫注射特定抗原，從卵黃中獲得特異性多克隆抗體的技術。IgY通過被動免疫方式使用，在畜禽和水產業的重大傳染病的防控和治療中發揮了巨大作用。

獲得高效價的卵黃抗體的關鍵是用抗原刺激使得機體產生持續的、穩定的抗體。免疫佐劑的應用是提高疫苗免疫效果的重要途徑之一，可增強免疫反應的強度和反應的持久性。中藥成分佐劑在提高疫苗免疫效果方面已經有很多研究，已有多種中藥多糖具有很好的免疫增強效果，中藥提高卵黃抗體效價的報道也有很多，如魯敏等證實蜂膠佐劑滅活苗能夠促進抗CPV的特異性卵黃抗體的產生，并能夠達到較高的抗體效價水平。鑒于豬藍耳病防治過程中經常出現疫苗免疫失敗及制備高免卵黃抗體的需要，亟須一種制備高效價的卵黃抗體的方法。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中存在的缺點與不足，提供一種豬藍耳病卵黃抗體的制備方法。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種豬藍耳病卵黃抗體的制備方法，具體包括以下步驟：

1）取20～30周齡的健康蛋雞，飼喂一周后，進行首次免疫，在首次免疫后14天、28天分別進行二次免疫和三次免疫，所述的首次免疫、二次免疫和三次免疫的處理方法相同，所述的免疫的方法為：肌肉分點免疫豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）活疫苗0.2ml/羽，同時通過飲水給藥喂食桑葉杜仲提取物5mg/羽；收集免疫后2～6周內所產的免疫PRRS疫苗的雞蛋；

2）將步驟1）收集的免疫PRRS疫苗的雞蛋，經75%酒精消毒后，用卵黃分離器分離蛋白，收集卵黃，棄卵黃膜，加相當于卵黃液9倍體積的酸化水（pH5.2）稀釋，充分攪拌，4℃冰箱中靜置超過6 h，10 000 r/min 4℃離心10 min，收集上清液獲得卵黃水提液（WaterSoluble Fraction，WSF)；

3）采用凍融法純化卵黃抗體IgY：置卵黃水提液于 -70℃冰箱中過夜，取出，解凍后10 000 r/min離心15min，棄去沉淀，收集上液，經0.22 μm濾膜過濾后，獲得純化后的豬藍耳病卵黃抗體IgY。

步驟1）中所述的蛋雞優選為羅曼蛋雞或白羽蛋雞。

步驟1）中所述的豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗優選為豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（R98株）。