[發(fā)明專利]豬繁殖與呼吸綜合征嵌合病毒RvHBJX及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410823151.7
• 申請日: 2014-12-25
• 公開（公告）號: CN104593336B
• 公開（公告）日: 2019-05-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蓋新娜;楊漢春;郭鑫;周磊;張家龍;顏忠;姚晟晨
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/85;C12N15/66;A61K39/12;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

1.豬繁殖與呼吸綜合征嵌合病毒，其特征在于，其為RvHBJX，是以低致病性PRRSV病毒毒株HB-1/3.9為骨架，高致病性PRRSV毒株JXwn06結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)直接替換低致病性PRRSV病毒毒株HB-1/3.9結(jié)構(gòu)蛋白后得到的嵌合病毒；

所述高致病性PRRSV毒株結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.豬繁殖與呼吸綜合征嵌合病毒RvHBJX全長cDNA克隆質(zhì)粒，其特征在于，通過以下方法構(gòu)建得到：

(1)以pWSK-JXwn為模板，PCR擴(kuò)增得到JXwn06的整個結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)，擴(kuò)增產(chǎn)物命名為HJSP-S2；

(2)以pWSK-HB-1/3.9為模板，分別PCR擴(kuò)增HB-1/3.9結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)兩側(cè)序列，分別命名為HJSP-S1、HJSP-S3；

(3)將步驟(1)和(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后，以HJSP-S1，HJSP-S2，HJSP-S3 3個片段作為模板，PCR擴(kuò)增得到HJSP-S123；

(4)HJSP-S123純化后經(jīng)Rsr II、Asc I雙酶切，連接到相同雙酶切的pWSK-HB-1/3.9質(zhì)粒中，完成PRRSV嵌合質(zhì)粒的構(gòu)建，命名為pW-HJSP；

其中，步驟(1)PCR擴(kuò)增使用的引物為JX-S2F和JX-S2R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2、3所示；

其中，步驟(2)PCR擴(kuò)增分別以HB-S1F、HB-S1R和HB-S3F、HB-S3R為引物，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO.4-7所示；

其中，步驟(3)PCR擴(kuò)增的引物為HJ-fusionF和HJ-fusionR，其核苷酸序列如SEQ IDNO.8-9所示。

3.制備權(quán)利要求1所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒嵌合病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)構(gòu)建豬繁殖與呼吸綜合征嵌合病毒RvHBJX全長cDNA克隆質(zhì)粒；

(2)嵌合病毒RvHBJX的拯救。

4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(1)的克隆質(zhì)粒通過以下方法構(gòu)建得到：

1)以pWSK-JXwn為模板，PCR擴(kuò)增得到JXwn06的整個結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)，擴(kuò)增產(chǎn)物命名為HJSP-S2；

2)以pWSK-HB-1/3.9為模板，分別PCR擴(kuò)增HB-1/3.9結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)兩側(cè)序列，分別命名為HJSP-S1、HJSP-S3；

3)將步驟1)和2)的擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后，以HJSP-S1，HJSP-S2，HJSP-S3 3個片段作為模板，PCR擴(kuò)增得到HJSP-S123；

4)HJSP-S123純化后經(jīng)RsrII、AscI雙酶切，連接到相同雙酶切的pWSK-HB-1/3.9質(zhì)粒中，完成PRRSV嵌合質(zhì)粒的構(gòu)建，命名為pW-HJSP；

步驟1)中PCR擴(kuò)增使用的引物為JX-S2F和JX-S2R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2、3所示；步驟2)中PCR擴(kuò)增分別以HB-S1F、HB-S1R和HB-S3F、HB-S3R為引物，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO.4-7所示；步驟3)中PCR擴(kuò)增的引物為HJ-fusionF和HJ-fusionR，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8-9所示。

5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(2)嵌合病毒RvHBJX的拯救通過以下方法來實現(xiàn)：

1)用Rsr II、Pac I內(nèi)切酶消化pW-HJSP全長cDNA克隆質(zhì)粒，使質(zhì)粒線性化；獲得的線性化質(zhì)粒經(jīng)酚氯仿抽提及無水乙醇沉淀、干燥后，紫外分光光度計測定純化后質(zhì)粒的濃度；

2)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；

3)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)TURBO DNase I消化后，用DMRIE-C脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染MARC-145細(xì)胞，每天觀察并記錄細(xì)胞病變CPE的產(chǎn)生情況，將出現(xiàn)明顯CPE的細(xì)胞培養(yǎng)上清在MARC-145細(xì)胞上進(jìn)行連續(xù)傳代，每代3-5d，獲得的拯救病毒即為RvHBJX。

6.含有權(quán)利要求1所述豬繁殖與呼吸綜合征嵌合病毒或其傳代培養(yǎng)病毒的疫苗。

7.權(quán)利要求1所述豬繁殖與呼吸綜合征嵌合病毒或其傳代培養(yǎng)病毒在制備疫苗中的用途。