[發(fā)明專利]連續(xù)法發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410822494.1
• 申請日: 2014-12-26
• 公開（公告）號: CN104498542A
• 公開（公告）日: 2015-04-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 付永前;朱華躍;蔣茹;姚俊;尹龍飛
• 申請（專利權(quán)）人: 臺州學院
• 主分類號: C12P7/56
• 分類號: C12P7/56;C12R1/845
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務所32230
• 代理人: 徐蓓

技術(shù)領(lǐng)域

???本發(fā)明為生物發(fā)酵領(lǐng)域，特別涉及利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法。

背景技術(shù)

L-乳酸是一種重要的有機酸，在食品行業(yè)、材料行業(yè)有廣泛的應用。其作為一種綠色化學品，可以合成聚乳酸、乳酸乙酯等可降解材料，因而在材料領(lǐng)域備受關(guān)注。目前，L-乳酸一般采用生物法合成，生產(chǎn)的菌種多為根霉屬微生物，如少根根霉Rhizopus?arrizhus、米根霉Rhizopus?oryzae等。其中，米根霉作為美國FDA認證的安全生產(chǎn)菌株，具有生長迅速、環(huán)境適應能力強、分泌有機酸及蛋白質(zhì)能力強等優(yōu)勢，為有機酸的優(yōu)秀生產(chǎn)菌種。

傳統(tǒng)米根霉生產(chǎn)?L-乳酸的技術(shù)中，幾乎都采用分階段的策略，如將乳酸的生產(chǎn)分為菌體生長和酸生產(chǎn)階段，并以此設(shè)計開發(fā)了相應的工藝，即：通過提供不同的培養(yǎng)基或者培養(yǎng)策略來適應該分階段培養(yǎng)技術(shù)需求。比如，在菌體生長階段，提供相應的培養(yǎng)基以供孢子的萌發(fā)以及菌體最初的需要，該培養(yǎng)基中富含菌體生長的營養(yǎng)，如蛋白胨、酵母膏、以及含氮的各種粉漿；在生長階段結(jié)束以后，富含營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基與具有轉(zhuǎn)化能力的菌體被轉(zhuǎn)運至用于生產(chǎn)的培養(yǎng)基中，經(jīng)過新環(huán)境的生長適應期，菌體生長并進行乳酸的生產(chǎn)，直至發(fā)酵結(jié)束。其中，分階段發(fā)酵策略最明顯的特征即進行的移種操作，移種量通常為發(fā)酵液體積的5-15%，通常的生長適應期也從12-24小時不等。該發(fā)酵策略帶來的技術(shù)問題在于，環(huán)境的改變會帶來遲滯期，遲滯期通常認為是對發(fā)酵不利的，如延長發(fā)酵的周期，部分菌體由于對環(huán)境的改變而失去代謝或者催化能力。為了解決遲滯的問題，現(xiàn)有技術(shù)也采取了各種工藝調(diào)整，如增加移種的量，雖然可以解決部分問題，但是也帶來不利的效果，比如移種量的加大會導致產(chǎn)量下降以及糖酸轉(zhuǎn)化率的降低。

米根霉產(chǎn)L-乳酸的產(chǎn)率、轉(zhuǎn)化率、以及生產(chǎn)強度都可以進一步提高。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在較高的葡萄糖濃度下，滿足微生物的生長要求，殘?zhí)强煽焖俚霓D(zhuǎn)化為乳酸。因此，為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本發(fā)明提供了一種連續(xù)法發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：連續(xù)法發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，其采用（1）經(jīng)過活化原始菌株，在（2）固體培養(yǎng)原始菌株獲得菌株孢子（3）將所述孢子與發(fā)酵罐中的原始培養(yǎng)基接觸（4）培養(yǎng)菌株并產(chǎn)生含乳酸的培養(yǎng)基（5）分離純化獲得乳酸，其中，步驟（3）至步驟（4）在同一發(fā)酵罐中進行。

本發(fā)明優(yōu)選的一種技術(shù)方案為：（1）活化原始菌株（2）采用固體培養(yǎng)原始菌株獲得菌株孢子（3）將所述孢子與發(fā)酵罐中的原始培養(yǎng)基接觸培養(yǎng)至（4）菌體生長階段結(jié)束，其中在菌體生長階段結(jié)束以后，通過固液分離，（5）分離部分培養(yǎng)基，（6）繼續(xù)培養(yǎng)菌株并產(chǎn)生含乳酸的培養(yǎng)基并（7）分離純化獲得乳酸；從而使得在同一發(fā)酵罐中進行的發(fā)酵過程進一步提高產(chǎn)率、轉(zhuǎn)化率、以及生產(chǎn)強度。

本發(fā)明優(yōu)選的另一中技術(shù)方案為：（1）活化原始菌株（2）采用固體培養(yǎng)原始菌株獲得菌株孢子（3）將所述孢子與發(fā)酵罐中的原始培養(yǎng)基接觸培養(yǎng)至（4）菌體生長階段結(jié)束，其中在菌體生長階段結(jié)束以后，通過固液分離，（5）分離部分培養(yǎng)基，在分離后的培養(yǎng)基中，流加入糖含量高于原培養(yǎng)基的糖溶液（6）繼續(xù)培養(yǎng)菌株并產(chǎn)生含乳酸的培養(yǎng)基并（7）分離純化獲得乳酸；

固液分離所得的培養(yǎng)基，在一個優(yōu)選的方案中，將該培養(yǎng)基用于下一批次發(fā)酵培養(yǎng)基的配置；在另一優(yōu)選的方案中，將該培養(yǎng)基用于該批次發(fā)酵培養(yǎng)基流加糖液的配置。經(jīng)過該優(yōu)選方案，實現(xiàn)了培養(yǎng)基的全利用。

本發(fā)明的技術(shù)方案中，菌株的活化采用平板進行培養(yǎng)，活化后的菌株接入固體培養(yǎng)基，其中采用PDA培養(yǎng)基進行孢子培養(yǎng)，于25-30℃培養(yǎng)5-14天，至平板表面布滿氣生菌絲并變?yōu)楹稚蛘吆诤稚Ｓ脽o菌生理鹽水沖洗獲得菌株孢子液，放置于放有無菌玻璃珠的三角瓶中，調(diào)節(jié)孢子濃度為1-9×10⁹個/mL，4℃保存待用。

在發(fā)酵培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中含有碳源、氮源與其他營養(yǎng)源。選擇的氮源為培養(yǎng)中常見的氮源，包括尿素、硝酸銨、碳酸銨、玉米漿、蛋白胨、牛肉膏等，其含量根據(jù)氮源選擇的不同，最適含量在0.5-4?g/L之間，如，優(yōu)選2?g/L的尿素，或者1?g/L的蛋白胨，或者2?g/L的牛肉膏/L作為氮源進行培養(yǎng)發(fā)酵。其他營養(yǎng)源，如磷酸鹽，無機鹽等營養(yǎng)因子的加入可在不同程度上改變?nèi)樗岬漠a(chǎn)量。