[發(fā)明專(zhuān)利]一種鞣酸加壓素的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410817217.1
• 申請(qǐng)日: 2014-12-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104672308A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-06-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉冠男;李靜潔;孫延年
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 青島康原藥業(yè)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C07K7/16
• 分類(lèi)號(hào): C07K7/16;C07K1/20
• 代理公司: 無(wú)
• 代理人: 無(wú)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及鞣酸加壓素的制備方法。

背景技術(shù)

鞣酸加壓素，是由九個(gè)氨基酸殘基組成的合成多肽，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為L(zhǎng)-Cys-L-Tyr-L-Phe-L-Gln-L-Asn-L-Cys-L-Pro-L-Arg-L-Gly(1→6)-二硫鍵鞣酸鹽，加壓素的理論分子量1084.24。鞣酸加壓素為抗利尿激素藥，能促進(jìn)遠(yuǎn)端腎小管及集合管對(duì)水分的重吸收而具有抗利尿作用，其制劑臨床用于治療尿崩癥。

目前已上市多肽藥物常見(jiàn)的純化方法大都采用了制備型高效液相色譜法，該法是獲得高純度多肽目標(biāo)分子的最有效的方法。一般多肽藥物純化制備工藝設(shè)計(jì)是先中低壓色譜富集目標(biāo)多肽，然后高壓色譜精制，但是考慮到我們目標(biāo)多肽血管緊張素分子量約1kD，無(wú)合適的分子篩凝膠柱(其上樣量小，流速低，處理量小，比較適合分子量大于10kD蛋白的脫鹽)或超濾膜選擇。而且中低壓色譜中常用的分離方法有分子篩色譜法、離子交換色譜法和疏水相互作用色譜法，這些色譜方法中用到的填料的粒徑通常從幾十微米到幾百微米不等，空隙尺寸多為幾百納米不等，無(wú)法得到高純度的目標(biāo)多肽。如果采用高鹽洗脫，后期處理無(wú)法找到合適的脫鹽方案，分離純化效果也有限，樣品損失很大，回收率計(jì)算也較復(fù)雜，對(duì)于后期反相制備很不利。

現(xiàn)在還缺乏一種有效的制備多肽鹽原料藥的方法，因此仍然迫切需要開(kāi)發(fā)新的多肽鹽的純化工藝。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于為了克服現(xiàn)有技術(shù)中鞣酸加壓素的制備工藝復(fù)雜、收率低的缺陷，而提供了一種鞣酸加壓素的制備方法。本發(fā)明的鞣酸加壓素的制備方法以鞣酸加壓素粗品為起始原料，經(jīng)過(guò)高壓反相色譜純化和脫鹽步驟，制備高純度的鞣酸加壓素的方法。

發(fā)明人經(jīng)過(guò)反復(fù)的研究發(fā)現(xiàn)，目前高壓反相色譜法經(jīng)典純化的填料是硅膠基質(zhì)，其柱效好，分辨率高，但色譜條件pH2-7耐受較窄；而安捷倫聚合物填料PLRP-S為苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物，可耐受較寬闊的pH范圍(pH范圍可達(dá)1-14)，并且可用1M?NaOH溶液再生，也可以精準(zhǔn)控制孔徑大小與孔徑形態(tài)，使得溶質(zhì)分子無(wú)障礙擴(kuò)散，相對(duì)于硅膠基質(zhì)，其增加了有效表面積，能保持很好的柱效和分辨率，且提升了填料的載樣量。

本發(fā)明提供了一種鞣酸加壓素的制備方法，其包括下述步驟：采用高效液相反相色譜法將加壓素粗品溶液依次進(jìn)行反相純化、反相脫鹽，即可；高效液相反相色譜法的填料為苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物。

所述的加壓素粗品溶液較佳地為加壓素粗品溶于體積百分比濃度為5％的乙腈水溶液形成的10g/L溶液。

其中，所述的反相純化的條件優(yōu)選如下：流動(dòng)相A為體積百分比為0.1％的三氟乙酸水溶液，流動(dòng)相B為體積百分比為0.1％的三氟乙酸乙腈溶液，流動(dòng)相C為所述的加壓素粗品溶液，流速為180～220mL/min(較佳地為200mL/min)，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm；

按照下表的條件進(jìn)行在線上樣、洗脫，百分比為體積百分比；