[發明專利]一種抗菌肽VIP類似肽及其制備方法

在審

• 申請號: 201410816827.X
• 申請日: 2014-12-24
• 公開（公告）號: CN104530215A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發明（設計）人: 徐春蘭;喬想金;孟堯;陳凱;高紫陽;牛衛寧;尚曉婭
• 申請（專利權）人: 西北工業大學
• 主分類號: C07K14/575
• 分類號: C07K14/575;C12N15/16;C12N15/70
• 代理公司: 陜西增瑞律師事務所 61219
• 代理人: 張瑞琪

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，涉及一種抗菌肽VIP類似肽及其制備方法。

背景技術

和諧畜牧業是我國當前畜牧業發展的主題，其重要內容之一就是動物-人-自然的和諧，而動物健康直接關系到動物源性食品品質與安全以及環境。然而，抗生素的大量使用甚至濫用導致病原菌耐藥性菌株甚至超級細菌產生、抗生素在畜禽產品中殘留以及隨動物糞尿排出污染環境等一系列嚴峻問題，嚴重影響了畜產品品質和人類健康。因此，研制安全、高效、環保型防病保健促生長添加劑來替代抗生素已顯得極為迫切。抗菌肽因其具有廣譜抗菌、耐熱、無毒無藥殘、不易產生耐藥菌株等眾多的優點，其研究開發已成為世界上研究抗生素新產品的前沿性課題，被認為是新型抗生素研究的新資源和重要途徑?？咕腣IP具有開發為防病保健飼料添加劑的優勢和潛力：(1)結構簡單明確：由28個氨基酸殘基組成的直鏈肽；(2)具有多種生物學活性，而且活性較強：免疫調節、抗炎，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等具有較強的抑殺作用；(3)作用濃度?。河捎赩IP屬于內源性的胃腸道激素類抗菌肽(腦腸肽)，因此，以較小的作用濃度(nmoL級)就能發揮較強的生物活性。VIP本身具有的特性使它具有開發為高效、安全的防病保健飼料添加劑的潛力和廣闊的應用前景。

然而，由于抗菌肽天然資源有限，化學合成肽類成本高，而基因工程方法大量表達抗菌肽使之成為新興飼料和飼料添加劑的途徑更為現實，并顯示出良好前景。隨著對抗菌肽構效關系、作用機制及其基因表達調控機制認識的不斷深化，設計高效、有利于人類健康的抗菌肽作為抗生素替代品是完全可行的。利用基因工程方法獲得抗菌肽的嘗試已在原核和真核體系獲得成功，但異源高效表達抗菌肽仍面臨多種困難，一是抗菌肽的編碼基因轉錄后的mRNA較小，一般只有100～200bp，同時其表達的抗菌肽在表達細胞中也容易被降解，很難實現抗菌肽的大量表達；二是抗菌肽具有抗菌作用，表達宿主，如細菌或酵母細胞表達的抗菌肽會反饋性抑制宿主細胞活性，影響抗菌肽的進一步表達。由此可見，如何進一步提高表達水平，在高表達的同時充分保持抗菌肽的生物學活性，提高基因表達產物的穩定性，設計并表達抗菌活性更強、抗菌譜更廣的抗菌肽等都是值得深入探究的問題。

發明內容

本發明的目的是提供一種抗菌肽VIP類似肽及其制備方法，以解決現有技術存在的結構復雜、抗菌活力不足和抗菌譜不廣的局限性。

本發明所采用的技術方案是，一種抗菌肽VIP類似肽，抗菌肽VIP類似肽為如下氨基酸序列：

HSKAVFTKNYTRLRKQMAVKKYLNSILN。

本發明所采用的另一種技術方案是，一種抗菌肽VIP類似肽的制備方法，按照以下步驟實施：

步驟1、抗菌肽VIP類似肽基因的合成：

根據GeneBank中抗菌肽VIP的氨基酸序列、結構特征和理化性質，將D3、D8替換為K3、K8，對其進行改良；改良后的氨基酸序列為：HSKAVFTKNYTRLRKQMAVKKYLNSILN；

將TrxA與改良抗菌肽VIP進行融合表達，在抗菌肽VIP類似肽的核苷酸序列3’端添加終止密碼子TAA，5’端添加了腸激酶(Enterokinase,EK)識別序列DDDDK，以便融合蛋白被EK切割，釋放出具有N端無額外氨基酸的VIP類似肽；使用XhoI和KpnI限制性內切酶構建重組質粒，在基因兩端分別設計了與pET32a(+)XhoI和KpnI位點相同的序列，便于雙酶切；

改良后的核苷酸序列為119bp：GGGGTACCGACGACGACGACAAGCACAGCAAGGCTGTCTTCACTAAGAACTACACTCGTCTGCGTAAGCAGATGGCTGTCAAGAAGTACCTGAACTCCATCCTGAACTAACTCGAGCGG，

上述序列中：方框顯示分別為XhoI和KpnI酶切位點；下劃線標識為EK識別序列；TAA為終止密碼子；黑體傾斜部分為VIP類似肽基因序列；

為了獲得上述目的基因，由此設計合成了3條引物P1、P2和P3，引物擴增長度為119bp，經測序鑒定說明已成功合成該抗菌肽基因；P1:5'-GGGGTACCGACGACGACGACAAGCACAGCAAGGCTGTCTTCACTAAGAACTACAC-3'；

P2:5'-CCGCTCGAGTTAGTTCAGGATGGAGTTCAGGTACTTCTTGACAGCCATCTG-3'；