[發明專利]一種抗菌肽VIP類似肽及其制備方法

在審

• 申請號: 201410816827.X
• 申請日: 2014-12-24
• 公開（公告）號: CN104530215A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發明（設計）人: 徐春蘭;喬想金;孟堯;陳凱;高紫陽;牛衛寧;尚曉婭
• 申請（專利權）人: 西北工業大學
• 主分類號: C07K14/575
• 分類號: C07K14/575;C12N15/16;C12N15/70
• 代理公司: 陜西增瑞律師事務所 61219
• 代理人: 張瑞琪

1.一種抗菌肽VIP類似肽，其特征在于，所述的抗菌肽VIP類似肽為如下氨基酸序列：HSKAVFTKNYTRLRKQMAVKKYLNSILN。

2.如權利要求1所述的一種抗菌肽VIP類似肽的制備方法，其特征在于，按照以下步驟實施：

步驟1、抗菌肽VIP類似肽的基因的合成：

根據GeneBank中抗菌肽VIP的氨基酸序列、結構特征和理化性質，將D3、D8替換為K3、K8，對其進行改良；改良后的氨基酸序列為：HSKAVFTKNYTRLRKQMAVKKYLNSILN；

將TrxA與改良抗菌肽VIP進行融合表達，在改良抗菌肽VIP核苷酸序列3’端添加終止密碼子TAA，5’端添加了腸激酶(Enterokinase,EK)識別序列DDDDK，以便融合蛋白被EK切割，釋放出具有N端無額外氨基酸的VIP類似肽；使用XhoI和KpnI限制性內切酶構建重組質粒，在基因兩端分別設計了與pET32a(+)XhoI和KpnI位點相同的序列，便于雙酶切；

改良后的核苷酸序列為119bp：

GGGGTACCGACGACGACGACAAGCACAGCAAGGCTGTCTTCACTAAGAACTACACTCGTCTGCGTAAGCAGATGGCTGTCAAGAAGTACCTGAACTCCATCCTGAACTAACTCGAGCGG，

上述序列中：方框顯示分別為XhoI和KpnI酶切位點；下劃線標識為EK識別序列；TAA為終止密碼子；黑體傾斜部分為VIP類似肽基因序列；

為了獲得上述目的基因，由此設計合成了3條引物P1、P2和P3，引物擴增長度為119bp，經測序鑒定說明已成功合成該抗菌肽基因；

P1:5'-GGGGTACCGACGACGACGACAAGCACAGCAAGGCTGTCTTCACTAAGAACTACAC-3'；

P2:5'-CCGCTCGAGTTAGTTCAGGATGGAGTTCAGGTACTTCTTGACAGCCATCTG-3'；

P3:5'---CTTCTTGACAGCCATCTGCTTACGCAGACGAGTGTAGTTCTTAGTGAAG---3'；

上述序列P1和P2中的方框分別表示XhoI和KpnI酶切位點；

步驟2、抗菌肽VIP類似肽重組大腸桿菌表達載體的構建和鑒定：

對重疊延伸PCR法(SOE-PCR)擴增獲得的基因和pET32a(+)分別同時進行雙酶切，然后進行連接，以將目的基因構建到到表達載體上，獲得的重組質粒可編碼TrxA-VIP2融合蛋白。使用雙酶切連接法構建重組質粒時，按外源基因與質粒摩爾數比為3：1的比例進行混合，反應體系為10uL，16℃過夜，同樣轉化DH5a感受態細胞，經測序進行鑒定，說明抗菌肽VIP類似肽的表達載體構建成功；

步驟3、抗菌肽VIP類似肽對大腸桿菌感受態細胞的轉化及誘導表達：將融合表達質粒pET32-VIP2轉化E.coliBL21(DE3)感受態細胞，得到pET32-VIP2/BL21(DE3)重組菌；重組菌接種至15mL?LB培養基中過夜培養，以BL21(DE3)和pET32a(+)為對照，按1％接種量分別接種于30mL新鮮培養基中，吸光度A600達0.6左右時用IPTG誘導(終濃度0.3mmol/L)，誘導前及誘導后4h分別測定A600，分別取適量的菌體量進行SDS-PAGE；

步驟4、融合蛋白的純化：

培養pET32-VIP2/BL21(DE3)，誘導表達4h后收集菌體，用A液(20mmol/L?PBS+0.5mol/L?NaCl,pH8.0)清洗，8000r/min離心5min，重復清洗1次，再以1:10的比例(V：OD)的比例將菌體重懸于A液，超聲破碎后，4℃15000r/min離心15min，收集上清液，經BeaverBeadsTM金屬離子螯合磁珠進行純化，以含500mmol/L咪唑的洗脫液洗脫，可得到純化后的融合蛋白TrxA-VIP2；

步驟5、抗菌肽VIP類似肽的釋放：

為獲得改良抗菌肽VIP，需用人工引入的腸激酶切割位點切割融合蛋白TrxA-VIP2，去除擔體蛋白，釋放目標抗菌肽；將純化后的融合蛋白經Sephadex?G-25柱脫鹽和超濾管濃縮后進行腸激酶切割，成功釋放重組表達抗菌肽VIP類似肽。