[發明專利]一種高效表達磷脂酶的方法

有效

• 申請號: 201410816825.0
• 申請日: 2014-12-24
• 公開（公告）號: CN104450756A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 吳敬;宿玲恰;吉得寧
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N15/81;C12N9/16;C11B3/00
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 張勇

技術領域

本發明涉及一種高效表達磷脂酶的方法，屬于酶工程技術領域。

背景技術

磷脂酶A1屬于水解酶，可專一水解天然磷脂Sn-1位酰基，得到Sn-2?；苎字陀坞x脂肪酸。磷脂酶A1已被應用于食品、醫藥、飼料和皮革等領域，尤其是在糧油脫膠方面的應用前景廣闊。同傳統的脫膠方法相比，酶法脫膠可大大節約化學物質的消耗量，幾乎不產生廢水，是一種經濟節約、高效穩定、綠色環保的具有國際領先水平的油脂脫膠方法。

最早將磷脂酶A1應用于油脂脫膠工業的是德國Lurgi公司，此酶來源于豬的胰臟，稱為“EnzyMax?process”，但是這種酶具有諸多缺點，如必須以鈣離子為激活劑，應用時需向反應體系中添加一定量的鈣離子；且該酶來源有限，價格比較昂貴。隨著研究的繼續深入，人們逐漸將微生物來源的磷脂酶應用于油脂脫膠。微生物來源的磷脂酶相繼在德國、美國等較大油脂公司得到了生產與應用，均獲得了較好的效果。目前已實現工業化生產的磷脂酶A1產品僅有丹麥諾維信公司的“Lecitase?Novo”和“LecitaseUltra”。磷脂酶A1應用于脫膠方面會有更大的發展前景。

國內關于磷脂酶A1的研究主要集中于直接篩選野生菌，通過發酵優化提高表達水平，或將原核來源的磷脂酶A1基因在大腸桿菌表達系統進行表達。司武陽等從富油土壤中初步篩選出生產磷脂酶Al的菌株，并從碳源、氮源、復合碳源、金屬離子等幾個方面對菌株產酶的發酵條件進行了優化，最高酶活達到18.68U/mL。付建紅等從新疆天山一號冰川凍土中篩選到一株產低溫堿性磷脂酶A1的菌株，經搖瓶優化，磷脂酶A1活力最高達17.5U/mL。王金梅等采用以磷脂為唯一碳源的限制性培養基，從富油土樣中篩選得到一株磷脂酶活性較高的菌株，利用該菌株生產的磷脂酶進行豆油脫膠研究，使得脫膠油中磷脂的去除率高達75.6％。國外用于食品級磷脂酶生產的安全菌株主要包括米曲霉和黑曲霉等，1988年，Michael?Givskova等從液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)基因組中克隆獲得磷脂酶A1基因，并在大腸桿菌(Escherichia?coli)中進行異源表達，其酶活不到1U/mL。1997年，KAGrant等將大腸彎曲桿菌(Campylobacter?coli)來源的磷脂酶A基因在大腸桿菌宿主表達，胞內酶活達到70U/mg。2000年，M?Hartmann等使用隨機化學突變、單細胞融合以及基因雜交技術，篩選出4株嗜熱四膜蟲屬(Tetrahymena?thermophila)突變株，其磷脂酶A1酶活最高達到35.2±2.6U/mL。最后延晉雷等克隆了液化沙雷氏菌磷脂酶A1的編碼基因，并在大腸桿菌中表達，重組菌胞外磷脂酶A1酶活達到128.7U/mL。目前國內外上罐的最高酶活為3500U/mL。

發明內容

本發明要解決的第一個技術問題是提供一種編碼磷脂酶A1的基因，其堿基序列如SEQ?ID?NO.1所示。

重組表達所述編碼磷脂酶A1的基因，能夠得到高活力的磷脂酶。

本發明要解決的第二個技術問題是提供一種高效表達所述磷脂酶A1的方法，是將SEQ?ID?NO.1所示的基因序列與畢赤酵母表達載體連接，然后將重組表達載體轉化入畢赤酵母中，發酵培養重組菌獲得磷脂酶A1。

在本發明的一種實施方式中，將SEQ?ID?NO.1所示的基因序列與畢赤酵母表達載體pPIC9K或pPICZα連接，獲得重組質粒，然后將重組表達質粒轉化入畢赤酵母中，發酵培養重組菌獲得磷脂酶A1。

在本發明的一種實施方式中，將重組菌活化后，接入裝液量30-40％發酵罐，以氨水控制pH值為5-6，培養溫度28-30℃，溶氧維持在30％左右，當甘油耗盡、溶氧迅速上升，開始流加甘油補料液，當菌體濃度達到OD₆₀₀＝95-105時，停止補料；保持基質匱乏狀態約1h后，開始誘導階段，設置誘導溫度28-30℃，添加0.3-0.5％甲醇，待重組菌適應甲醇，溶氧開始下降后，維持甲醇濃度0.3-0.5％，誘導磷脂酶A1表達。