[發(fā)明專利]基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的單增李斯特菌的層析試紙條

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410815563.6
• 申請日: 2014-12-23
• 公開（公告）號: CN104483459A
• 公開（公告）日: 2015-04-01
• 發(fā)明（設計）人: 張捷;王小晉;王靜;張錫全;尚士進;康西西;張曉光;舒咬根;陳廣全
• 申請（專利權）人: 北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心;中華人民共和國淮安出入境檢驗檢疫局;威海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: G01N33/02
• 分類號: G01N33/02;G01N33/577
• 代理公司: 北京三聚陽光知識產(chǎn)權代理有限公司 11250
• 代理人: 趙敏

技術領域

本發(fā)明屬于食品檢測領域，具體地說涉及一種基于低噪聲激發(fā)式熒光染料標記的單增李斯特菌免疫層析試紙條及其制備方法與應用。

背景技術

單核細胞增生李斯特氏菌簡稱單增李斯特菌，是一種人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多。它廣泛存在于自然界中，食品中存在的單增李氏菌對人類的安全具有危險，該菌在4℃的環(huán)境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一，因此，在食品衛(wèi)生微生物檢驗中，必須加以重視。目前，單增李斯特菌已經(jīng)作為致病菌檢測的一項重要指標，在公共衛(wèi)生、食品衛(wèi)生、畜牧獸醫(yī)和出入境檢驗檢疫中均有重要的意義，同時也對單增李斯特菌的快速及高精度的定量檢測提出了更高的要求。為探求快速、準確、高靈敏度、易操作且能夠定量的檢測方法，世界各國學者進行了大量研究，從以傳統(tǒng)方法為基礎發(fā)展到以免疫學、分子生物學為基礎的快速檢測方法，并在實踐中不斷取得新進展。

免疫層析技術是一項有效結合了層析法卓越分離能力和免疫反應高度特異性的新型免疫檢測技術，當前在疾病快速診斷、環(huán)境污染物分析及致病生物因子檢定等領域得到廣泛應用。其原理是將特異抗原或抗體固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當該干燥的硝酸纖維素膜一端浸入樣品后，由于毛細管作用，樣品將沿著該膜向前移動，當遷移至交聯(lián)標記抗體的特定區(qū)域時，樣品中相應的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結合形成抗原-標記抗體復合物，經(jīng)標記物的顯色、發(fā)光或電化學反應而使該區(qū)域顯示一定的信號，從而實現(xiàn)特異性免疫診斷。常用的標記物包括生色型探針(包括膠體金、膠體碳、著色微球等)和熒光分子(如有機熒光染料、量子點、稀土元素配合物、上轉磷光顆粒等)。

然而上述的標記物卻存在靈敏度有限且無法實現(xiàn)精確定量檢測等缺陷，進而限制了免疫層析技術的廣泛應用。如現(xiàn)有技術中常見的利用酶標記催化生色底物的酶促反應而顯色，可用于抗原或抗體的直接檢測，將該方法應用于食品中單增李斯特菌的檢測，通過單克隆抗體大大降低假陽性率，但是該方法的靈敏度較分子生物學方法低，且必須經(jīng)過增菌篩選純培養(yǎng)步驟，因此難以在短時間內(nèi)得到檢測結果。

對于現(xiàn)有的膠體金免疫層析技術，通過膠體金等納米顆粒的聚集反應而顯色，從而實現(xiàn)結果判定。雖然該種方法具有便捷、快速、準確和無污染等特點被廣泛應用于醫(yī)學檢測和臨床診斷，在病原體檢測方面，其敏感性、特異性具有其他免疫學方法無可比擬的優(yōu)勢，且無需特殊儀器設備，對檢測人員的專業(yè)要求低，有良好的基層應用開發(fā)前景。但這種方法中存在標記物的穩(wěn)定性較差，顏色單一，靈敏度較低，受基質(zhì)的背景干擾大等缺陷，且只能定性檢測，不能做到精確定量檢測，上述標記靈敏度有限且無法實現(xiàn)精確定量，限制了免疫層析技術的應用。

另外，現(xiàn)有免疫層析技術一直主要用于對蛋白類的檢測，對于微生物的檢測則所見甚少，同時更難以實現(xiàn)微生物的定量檢測，對于快速檢測致病菌而言，其應用受到極大的限制。

發(fā)明內(nèi)容

為此，本發(fā)明所要解決的技術問題在于現(xiàn)有技術中難于快速定量檢測單增李斯特菌的問題，進而提供一種基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的單增李斯特菌免疫層析試紙條，并進一步公開了其應用。

為解決上述技術問題，本發(fā)明提供的一種低噪聲激發(fā)式熒光單增李斯特菌免疫層析試紙條，包括：

底板以及沿所述底板的長度方向上依次粘附在所述底板上的樣品墊、結合墊、抗體承載膜和吸水墊，且所述樣品墊、結合墊、抗體承載膜和吸水墊之間，依次與且僅與相鄰部位相接觸且部分重疊；所述抗體承載膜粘附于所述底板的中間部位，其上設置有相間隔的檢測線和質(zhì)控線，所述檢測線靠近所述結合墊，所述質(zhì)控線靠近所述吸水墊；

所述結合墊上噴涂有低噪聲激發(fā)式熒光染料標記的可與所述單增李斯特菌特異性結合的單克隆抗體；

所述檢測線由可與所述單增李斯特菌特異性結合的多克隆抗體涂層形成；所述質(zhì)控線由與所述單增李斯特菌以及所述可與單增李斯特菌特異性結合的多克隆抗體均無關的抗體涂層形成。

所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的單增李斯特菌免疫層析試紙條，所述結合墊上噴涂的所述可與單增李斯特菌特異性結合的單克隆抗體為鼠抗單增李斯特菌單克隆抗體(Pierce抗體公司)。

所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的單增李斯特菌免疫層析試紙條，形成所述檢測線的所述可與單增李斯特菌特異性結合的多克隆抗體為鼠抗單增李斯特菌多克隆抗體(Pierce抗體公司)。

任一所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的單增李斯特菌免疫層析試紙條，形成所述質(zhì)控線的抗體為羊抗鼠IgG多克隆抗體。