[發明專利]基于低噪聲激發式熒光標記的單增李斯特菌的層析試紙條

在審

• 申請號: 201410815563.6
• 申請日: 2014-12-23
• 公開（公告）號: CN104483459A
• 公開（公告）日: 2015-04-01
• 發明（設計）人: 張捷;王小晉;王靜;張錫全;尚士進;康西西;張曉光;舒咬根;陳廣全
• 申請（專利權）人: 北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心;中華人民共和國淮安出入境檢驗檢疫局;威海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: G01N33/02
• 分類號: G01N33/02;G01N33/577
• 代理公司: 北京三聚陽光知識產權代理有限公司 11250
• 代理人: 趙敏

1.一種基于低噪聲激發式熒光標記的單增李斯特菌免疫層析試紙條，其特征在于，包括：

底板(7)以及沿所述底板(7)的長度方向上依次粘附在所述底板上的樣品墊(1)、結合墊(2)、抗體承載膜(3)和吸水墊(6)，且所述樣品墊(1)、結合墊(2)、抗體承載膜(3)和吸水墊(6)之間，依次與且僅與相鄰部位相接觸且部分重疊；所述抗體承載膜(3)粘附于所述底板(7)的中間部位，其上設置有相間隔的檢測線(4)和質控線(5)，所述檢測線(4)靠近所述結合墊(2)，所述質控線(5)靠近所述吸水墊(6)；

所述結合墊(2)上噴涂有低噪聲激發式熒光染料標記的可與所述單增李斯特菌特異性結合的單克隆抗體；

所述檢測線(4)由可與所述單增李斯特菌特異性結合的多克隆抗體涂層形成；所述質控線(5)由與所述單增李斯特菌以及所述可與單增李斯特菌特異性結合的多克隆抗體均無關的抗體涂層形成。

2.根據權利要求1所述的基于低噪聲激發式熒光標記的單增李斯特菌免疫層析試紙條，其特征在于，所述結合墊(2)上噴涂的所述可與單增李斯特菌特異性結合的單克隆抗體為鼠抗單增李斯特菌單克隆抗體。

3.根據權利要求1或2所述的基于低噪聲激發式熒光標記的單增李斯特菌免疫層析試紙條，其特征在于，形成所述檢測線(4)的所述可與單增李斯特菌特異性結合的多克隆抗體為鼠抗單增李斯特菌多克隆抗體。

4.根據權利要求1-3任一所述的基于低噪聲激發式熒光標記的單增李斯特菌免疫層析試紙條，其特征在于，形成所述質控線(5)的抗體為羊抗鼠IgG多克隆抗體。

5.根據權利要求1-4任一所述的基于低噪聲激發式熒光標記的單增李斯特菌免疫層析試紙條，其特征在于，所述的低噪聲激發式熒光染料為發射波長為650-1000nm的熒光分子。

6.根據權利要求5所述的基于低噪聲激發式熒光標記的單增李斯特菌免疫層析試紙條，其特征在于，所述的低噪聲激發式熒光染料為NHS活化的低噪聲激發式熒光染料DyLight800。

7.一種制備權利要求1-6任一所述的基于低噪聲激發式熒光標記的單增李斯特菌免疫層析試紙條的方法，其特征在于，包括如下步驟：

A)取以PBS緩沖液稀釋10倍的所述低噪聲激發式熒光染料，染料與沙門氏菌單克隆抗體按1:2質量比混合均勻，室溫條件下避光反應2小時，隨后將所得的標記產物放入含有PBS緩沖液的透析袋中，4℃透析4小時，向所述標記好的標記產物中添加終濃度為1.5％BSA、0.15％Tween20和0.15‰疊氮化鈉，4℃保存，備用；

B)在所述結合墊(2)上噴涂以層析緩沖液稀釋20000倍后的上述步驟A)中的所述標記產物，然后室溫風干，備用；

C)使用含5％BSA，0.1％Tween?20的PBS緩沖液噴涂在所述樣品墊(1)上，室溫風干后，備用；

D)分別取所述單增李斯特菌多克隆抗體和所述與單增李斯特菌以及可與單增李斯特菌特異性結合的多克隆抗體均無關的抗體用劃線機在所述抗體承載膜(3)上劃所述檢測線(4)和所述質控線(5)，室溫風干，備用；

E)將上述步驟獲得的所述樣品墊(1)、所述結合墊(2)、所述抗體承載膜(3)和所述吸水墊(6)沿所述底板(7)的長度方向上依次粘附，然后切割成試紙條，即得。

8.權利要求1-6任一所述的基于低噪聲激發式熒光標記的單增李斯特菌免疫層析試紙條在定性及定量檢測單增李斯特菌領域中的用途。

9.一種利用權利要求1-6任一所述的基于低噪聲激發式熒光標記的單增李斯特菌免疫層析試紙條檢測單增李斯特菌的方法，其特征在于，包括如下步驟：

a)以pH為7.4的PBS緩沖液稀釋處理待測樣品，取上清液作為待檢樣，另取所述PBS緩沖液作為陰性對照，分別以利用權利要求1-6任一所述的試紙條進行免疫層析檢測；

b)熒光掃描所述檢測線(4)和所述質控線(5)，分別測定所述檢測線(4)和所述質控線(5)區域的熒光強度，若所述質控線(5)區域出現熒光發射峰，則表明該試紙條有效，反之則無效；若所述檢測線(4)區域同時出現熒光發射峰則為陽性結果，反之則為陰性。

10.根據權利要求9所述的檢測單增李斯特菌的方法，其特征在于，還包括制備標準曲線及定量檢測的步驟：其中，

所述制備標準曲線的步驟包括：取單增李斯特菌菌株標準品配制成1-100倍梯度濃度的系列標準品；并將上述濃度系列標準品分別用所述的試紙條進行免疫層析，熒光掃描所述檢測線(4)和所述質控線(5)，分別測定所述檢測線(4)和所述質控線(5)區域的熒光強度，制作抗原濃度與熒光強度比之間關系的標準曲線，并擬合方程；

所述定量檢測的步驟包括：取待測樣品以所述的試紙條進行免疫層析檢測，利用上述標準曲線及方程計算得到所述單增李斯特菌濃度。