[發明專利]產纖維素酶和產納他霉素的重組利迪鏈霉菌與應用

在審

• 申請號: 201410815257.2
• 申請日: 2014-12-24
• 公開（公告）號: CN104480135A
• 公開（公告）日: 2015-04-01
• 發明（設計）人: 吳慧玲;劉偉成;李錦錦;劉霆;董丹;張濤濤;盧彩鴿;張殿朋;劉德文;田兆豐
• 申請（專利權）人: 北京市農林科學院
• 主分類號: C12N15/76
• 分類號: C12N15/76;C12N1/21;C12N9/42;C12P19/62;A01N63/00;A01N63/02;A01P3/00;C12R1/465
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及生物工程領域中產纖維素酶和產納他霉素的重組利迪鏈霉菌與應用。

背景技術

隨著世界人口的增多和耕地面積的下降，糧食供應日益嚴峻，然而農作物病蟲害的常年發生給世界經濟帶來了巨大損失(陳軍等，2010)。我國是以種植業為基礎的農業大國，通過使用農藥每年可減少經濟損失達300億元左右。其中，化學農藥施用量占農藥用量的80％以上，這造成嚴重的環境污染、農藥殘留等問題，嚴重威脅著人類的健康和生態環境。因此，生物防治是農藥發展的必然趨勢。其中鏈霉菌由于次生代謝產物豐富而廣泛應用于農業生物防治中，已經產生了巨大的經濟效益、社會效益和生態效益。隨著抗藥性及病害多元性的發展，高效多功能生防制劑的研發成為人們關注的熱點。但是，作為天然菌株，單一菌株的代謝產物種類有限，會出現抑菌機制單一，抑菌能力差，抑菌譜窄等現象。

利迪鏈霉菌(Streptomyces?lydicus)A02(授權公告號為CN100467588C的中國發明專利)是分離自北京郊區的一株產納他霉素的放線菌，該菌具有較強的抗真菌活性,對灰霉病菌(Botrytis?cinerea)、番茄早疫病菌(Alternayia?solani)、小麥赤霉病菌(Fusarium?graminearium)、番茄葉霉病菌(Fulvia?fulva)、芹菜斑枯病菌(septoria?apiicola)、大蔥紫斑病菌(Alternaria?poprri)、水稻稻瘟病菌(Pyricularia?oryzae)、玉米大斑病菌(Exserohilum?turcicum)等多種植物真菌性氣傳病害的病原菌有明顯的抑制作用，為了開發防效更好的植物病害生防制劑，需要研發抗菌活性更高的新菌株。

發明內容

本發明所要解決的一個技術問題是如何提高利迪鏈霉菌產納他霉素的能力及降解纖維素的能力。

為了解決上述技術問題，本發明首先提供了構建產纖維素酶和納他霉素的重組利迪鏈霉菌的方法。

本發明所提供的構建重組利迪鏈霉菌的方法，包括將所述血紅蛋白的編碼基因和所述纖維素酶的編碼基因的表達載體導入作為宿主菌的利迪鏈霉菌中，得到產纖維素酶和納他霉素的重組利迪鏈霉菌的步驟；

所述血紅蛋白是如下A1)或A2)的蛋白質：

A1)氨基酸序列是序列表中SEQ?ID?No.3的蛋白質；

A2)將序列表中SEQ?ID?No.3中的一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有血紅蛋白功能的由A1)衍生的蛋白質；

所述纖維素酶是如下B1)或B2)的蛋白質：

B1)氨基酸序列是序列表中SEQ?ID?No.4的蛋白質；

B2)將SEQ?ID?No.4中的一個或幾個氨基酸殘基取代和/或缺失和/或添加且具有纖維素酶功能的由B1)衍生的蛋白質；

所述表達載體從上游至下游的方向(即轉錄方向)含有紅霉素抗性基因啟動子、所述纖維素酶的編碼基因、所述紅霉素抗性基因啟動子、所述血紅蛋白的編碼基因。

其中，SEQ?ID?No.3由146個氨基酸殘基組成，SEQ?ID?No.4由493個氨基酸殘基組成。

上述A2)和B2)中的蛋白質均可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述A2)中的蛋白質的編碼基因可通過將SEQ?ID?No.1的第7-447位核苷酸或SEQ?ID?No.2的第1692-2132位核苷酸所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變得到；上述B2)中的蛋白質的編碼基因可通過將SEQ?ID?No.1的第653-2134位核苷酸或SEQ?ID?No.2的第7-1488位核苷酸所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變得到。

上述構建產纖維素酶和納他霉素的重組利迪鏈霉菌的方法中，所述血紅蛋白可為透明顫菌血紅蛋白。

上述構建產纖維素酶和納他霉素的重組利迪鏈霉菌的方法中，所述血紅蛋白的編碼基因為下述A11)-A13)中的任一種DNA分子：

A11)編碼序列為序列表中SEQ?ID?No.1的第7-447位核苷酸或SEQ?ID?No.2的第1692-2132位核苷酸的cDNA分子或基因組DNA；

A12)在嚴格條件下與A11)限定的DNA分子雜交且編碼所述血紅蛋白的cDNA分子或基因組DNA；