[發明專利]一種γ -谷氨酰轉肽酶與伴侶蛋白共表達重組質粒構建方法及應用

在審

• 申請號: 201410812443.0
• 申請日: 2014-12-23
• 公開（公告）號: CN104560849A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 殷志敏;王期;蔣毅;蘭蕾
• 申請（專利權）人: 南京師范大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P13/04;C12R1/19
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體地說，是關于構建一株具有極高谷氨酰轉肽酶轉移酶活性的大腸桿菌基因工程菌，通過酶轉化合成茶氨酸的生產方法。

背景技術

L-茶氨酸(N-乙基-γ谷氨酰胺，theanine)是一種天然的氨基酸，是茶葉中的特征氨基酸，也是茶葉中有效的呈味物質。L-茶氨酸主要用于：(1)作為一種新興的食品添加劑，可用作為茶飲料的品質改良劑、改善食品風味的添加劑、功能食品的添加劑、“情緒食品”的添加劑等；已在歐美、日本、中國臺灣等國家、地區廣泛使用。如日本已開發出添加茶氨酸的巧克力、果凍、布丁、口香糖、保健茶和各種清涼飲料。(2)作為醫藥中間體領域，茶氨酸可以用作抗腫瘤、降血壓、安神鎮靜、抗疲勞等藥物中。此外L-茶氨酸現已作為鎮靜劑中的有效成分，對帕金森氏癥、老年性癡呆、傳導神經功能紊亂等疾病起預防效果。

L-茶氨酸的生產方法主要有茶葉提取法、化學合成法、微生物發酵酶轉化法。(1)茶葉提取法由于茶葉中茶氨酸的含量不高，從茶葉提取茶氨酸無實際生產價值。所以植物提取法實際上是從提取茶多酚后的殘留液中用離子交換樹脂法提取茶氨酸。缺點是生產工序復雜、產品純度低、產量小、價格高。(2)化學合成L-茶氨酸需要高溫、高壓及化學催化劑等條件，反應條件要求比較高，副產物多，且產生的都是DL-型消旋體，還需要進行拆分才能得到L-型產品。因此會使成本提高以及質量難以控制，且易混雜有毒物質，產品不宜用于食品行業應用，同時生產工藝復雜，且易造成環境污染。(3)微生物發酵酶轉化法生產的L-茶氨酸都是L型的，且生產成本低，可大量生產，由于生物酶法合成具有高度的專一性，所以在產品質量方面更接近天然的L-茶氨酸，其發展前景非常廣闊。此外酶轉化法生產L-茶氨酸還具有純度高、副產物少、純化步驟少、生產能力強等優點，因此微生物發酵酶轉化法是目前國內外研究人員公認的最直接、最經濟的L-茶氨酸生產方法。

利用微生物發酵酶轉化法生產L-茶氨酸的酶主要有谷氨酰胺酶和γ-谷氨酰轉肽酶(γ-GGT)，本實驗是研究利用大腸桿菌發酵產γ-谷氨酰轉肽酶，該大腸桿菌高產高酶活的γ-谷氨酰轉肽酶，能高效轉化谷氨酰胺和乙胺為L-茶氨酸；近些年來，盡管有研究把大腸桿菌K-12來源的γ-ggt基因(全長序列或突變缺失序列)導入到大腸桿菌中表達，通過采用不同的融合標簽的載體或大小亞基的共表達，但重組谷氨酰轉肽酶常常以沒有活性的包涵體或沒有活性的酶原形式被表達出來。究其原因，主要是谷氨酰轉肽酶復雜的翻譯后加工過程，造成表達和轉運后的大小亞基不能正確折疊并且不能有效地相互作用，因此不能形成天然的成熟酶。這樣的事實使得高效過表達具有生物活性的谷氨酰轉肽酶成為一個難題。因而，尋求新的方法改進基因工程菌株以從根本上提高茶氨酸的合成量顯得尤為重要。

發明內容

本發明所要解決的是提供一種伴侶蛋白或伴侶蛋白組合分別與谷氨酰轉肽酶共表達的系統，用于構建高效表達谷氨酰轉肽酶的菌株，以便于酶轉化合成茶氨酸。

一種具有谷氨酰轉肽酶酶活的大腸桿菌基因工程菌，該基因工程菌是以大腸桿菌BL21(DE3)為宿主菌，宿主菌中共轉化有伴侶蛋白表達質粒pG-Tf2與谷氨酰轉肽酶表達質粒。

本發明還公開了所述大腸桿菌基因工程菌在生產茶氨酸中的應用。

一種利用谷氨酰轉肽酶重組質粒生產茶氨酸的方法，是用伴侶蛋白表達質粒pG-Tf2與谷氨酰轉肽酶表達質粒共轉化大腸桿菌得到共轉化子，誘導培養該共轉化子；以經誘導培養的共轉化子為酶源，谷氨酰胺和乙胺為轉化底物，酶促合成茶氨酸。

上述方法中，誘導培養條件優選如下：將共轉化子菌液接入含有氨芐青霉素和氯霉素抗性液體TB培養基中，其中，TB培養基中加有10ng/ml四環素作為伴侶蛋白的誘導劑；振蕩培養至OD600值為1.2后，加入終濃度為0.5mM的IPTG，20℃下誘導16h。

本發明提供的利用谷氨酰轉肽酶重組質粒生產茶氨酸的技術方案是在以下大量實驗的基礎上獲得的。：

(1)將5種伴侶蛋白表達質粒分別與谷氨酰轉肽酶表達質粒共轉化大腸桿菌BL21(DE3)；

(2)谷氨酰轉肽酶和伴侶蛋白在五種共表達體系中的蛋白誘導表達；

(3)五種共表達體系中，通過檢測谷氨酰轉肽酶的表達量及酶活，篩選出

pG-Tf2伴侶蛋白表達質粒的共轉化子表現出最佳的谷氨酰轉肽酶酶活；

(4)pG-Tf2伴侶蛋白表達質粒與谷氨酰轉肽酶最佳共表達條件的優化；