[發明專利]一種谷物種子胚乳細胞的形態學分析方法

在審

• 申請號: 201410811254.1
• 申請日: 2014-12-23
• 公開（公告）號: CN104450859A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 韋存虛;蔡燦輝;趙凌霄
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明涉及植物種子檢測技術領域，特別是涉及一種谷物種子胚乳細胞的形態學分析方法。

背景技術

水稻、小麥、玉米等谷類作物的種子是人類糧食、牲畜飼料和工業原料的主要來源。胚乳細胞是谷物種子的重要組成部分，它的發育和充實狀況決定著種子的重量(粒重)與品質。谷物種子的粒重與胚乳細胞的數目具有顯著的相關性，胚乳細胞數目的增加導致粒重的增加。谷物種子的粒形(粒長、粒寬、粒厚)受胚乳細胞的數目、長度、寬度等形態學特征的影響。因此，對胚乳細胞的形態學特征進行分析，能夠從細胞學角度研究谷物種子的發育和充實，進而闡明導致種子品質發生差異的細胞學原因，為谷物的育種、加工和利用提供理論依據，對提高種子的品質和產量具有重要的意義。

目前，對谷物種子胚乳細胞的研究主要采用以下2種方法進行：①利用纖維素酶分解胚乳細胞壁，將胚乳細胞分離開再進行分析；②利用切片技術將胚乳細胞切開，再通過染色技術顯示出胚乳細胞的輪廓以及內容物后分析。其中，方法①存在較大的弊端：a)纖維素酶分解胚乳細胞壁的操作較復雜，對酶濃度以及酶解時間的要求非常嚴格，濃度過高、時間過長將導致細胞壁被破壞，而濃度過低、時間過短將導致胚乳細胞分離不充分，最終導致胚乳細胞的分析不準確；b)纖維素酶分解胚乳細胞的過程容易造成細胞的損失，最終導致胚乳細胞數目的統計不準確；c)分離的胚乳細胞是混合物，無法準確定位胚乳不同部位胚乳細胞的形態學特征；d)無法分析胚乳細胞內容物(淀粉和蛋白)的特性。而方法②很好地解決了方法①的諸多弊端，但仍存在缺陷：a)染色后細胞的輪廓不夠清晰，造成分析的困難；b)分析的手段單一、過程復雜，耗費大量時間，且精確度較低；c)無法大批量分析，且分析的形態學特征太少。

目前，已有不少生命科學領域的學者利用各種專業軟件對顯微物體的形態學特征進行了分析，如：①用Smileview對淀粉體和蛋白體進行手動測量；②用Image?J軟件分析水稻淀粉粒的幾何特性、測量肝臟體積；③用PractiStat軟件分析小麥大、小淀粉粒的軸長；④用Photoshop和Image-Pro?Plus軟件分析小麥胚乳淀粉粒的幾何特性等。其中前三種方法操作復雜，隨意性較大，導致誤差很大；而第④種方法先采用了Photoshop軟件的“魔棒”和“橡皮擦”工具對淀粉粒進行摳圖和著色，再利用Image-Pro?Plus軟件的“count/size”工具對所有上色淀粉粒進行精確的分析，相比前三種方法，極大地簡化了操作步驟，并能批量化分析目標的形態學特征，操作簡便，結果精確。但第④種方法依舊存在以下缺陷：a)Photoshop軟件的“魔棒”工具只適用于如淀粉粒、蛋白體等單一、均質的目標，不適用于內含許多異質內容物的目標，比如內含大量蛋白體、淀粉粒的谷物胚乳細胞；b)Photoshop軟件的“魔棒”工具和“橡皮擦”工具只適用于數量較少且較分散的目標，因為當目標數量很多并且分布很緊湊時，“魔棒”工具就無法快速的將每個目標區分開，需要借助其他工具(如“套索”工具)區分目標，同時該工具選中的區域為選區，無法進行保存，必須一次性處理完所有目標；c)著色過程太復雜，必須借助“橡皮擦”工具對每一個目標的邊緣進行精確地處理，工作量依舊很大。現有的技術方法已不能滿足分析谷物種子胚乳細胞的形態學特征，因為：①谷物種子的胚乳細胞相互間緊挨著，且內含大量蛋白體和淀粉粒，“魔棒”工具無法準確勾勒細胞的輪廓；②若采用“套索”工具進行勾勒，則需要對每個細胞進行描邊和著色，谷物種子的胚乳細胞數量眾多，工作量巨大；③著色操作需要借助“橡皮擦”工具對每一個目標的邊緣進行精確地處理，操作較繁瑣。因此，需要亟需對現有的胚乳細胞形態學分析方法進行改良和優化，發明一種谷物種子細胞的形態學分析方法。

經過長時間的摸索，我們利用Photoshop軟件的“鋼筆工具”對胚乳細胞的顯微圖片進行簡便、快捷、精確的前處理，生成細胞輪廓清晰、反差明顯的圖片，再運用Image-Pro?Plus軟件對細胞進行精確的分析，形成了一套行之有效的分析方法，很好的彌補了現有方法的缺陷。發明內容

為了克服現有胚乳細胞形態學分析方法的不足，本發明提供了一種谷物種子胚乳細胞的形態學分析方法。

本發明所采用的技術方案如下：

一種谷物種子胚乳細胞的形態學分析方法，包括以下步驟：

(1)樹脂切片的制作：

①取材和固定：采集谷物的種子，小心取出完整穎果，浸泡在4％多聚甲醛--2.5％戊二醛固定液中24h；