[發(fā)明專利]一種谷物種子胚乳細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410811254.1
• 申請日: 2014-12-23
• 公開（公告）號: CN104450859A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 韋存虛;蔡燦輝;趙凌霄
• 申請（專利權(quán)）人: 揚州大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 南京知識律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 盧亞麗

1.一種谷物種子胚乳細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析方法，包括以下步驟：(1)樹脂切片的制作；(2)切片的染色；(3)圖像的采集；(4)圖像的前處理；(5)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析，其特征在于，步驟(4)圖像的前處理利用Photoshop軟件的鋼筆工具對種子細(xì)胞的輪廓進行精確的勾勒和描邊。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的形態(tài)學(xué)分析方法，其特征在于，具體步驟如下：

(1)樹脂切片的制作

①取材和固定：采集谷物的種子，小心取出完整穎果，浸泡在4％多聚甲醛--2.5％戊二醛固定液中24h；

②漂洗和脫水：用0.1M磷酸緩沖液充分漂洗固定后的穎果，再用30％-50％-70％-90％-100％-100％乙醇對穎果逐級脫水，每級15min；

③樹脂滲透、包埋和聚合：用25％-50％-75％-100％-100％倫敦白膠樹脂對穎果逐級滲透，每級12h，再將滲透完的穎果放于包埋模具內(nèi)，注入純樹脂，將包埋模具放在烘箱內(nèi)，60℃聚合1-2天，使樹脂硬化；

④修塊和半薄切片：對包埋塊進行手工修塊，削去穎果周圍多余樹脂，用超薄切片機切厚度為2微米的切片，將切片轉(zhuǎn)移到載玻片上的水滴上，將載玻片放在45℃加熱板上干燥，使切片展平；

(2)切片的染色：用碘液、番紅-甲基紫染液或熒光增白劑染液對展平的切片染色，通過對細(xì)胞內(nèi)容物的染色反襯出細(xì)胞輪廓或直接對細(xì)胞壁進行染色顯示細(xì)胞輪廓；

(3)圖像的采集：在光學(xué)顯微鏡下拍攝切片上胚乳細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，保存圖片；

(4)圖像的前處理：用Photoshop軟件打開拍攝的圖片，利用鋼筆工具對種子細(xì)胞的輪廓進行精確的勾勒，再用畫筆工具對路徑進行描邊，保存圖片；

(5)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析：用Image-Pro?Plus軟件打開前處理的圖片，利用“Count/Size”工具對胚乳細(xì)胞進行形態(tài)學(xué)分析。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的形態(tài)學(xué)分析方法，其特征在于，步驟(3)中，圖像的采集過程在光學(xué)顯微鏡下進行：

①當(dāng)使用碘液或番紅-甲基紫染液進行染色時，采用正常光模式進行拍攝；

②當(dāng)使用熒光增白劑染液進行染色時，采用熒光模式進行拍攝。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的形態(tài)學(xué)分析方法，其特征在于，步驟(4)中，所述圖像的前處理具體操作如下：

①用Photoshop軟件打開拍攝的圖片，用“矩形選框工具”選出待分析的區(qū)域，點選菜單欄的“編輯”-“拷貝”，再點選“文件”-“新建”，彈出的對話框中將分辨率改為“300”，背景內(nèi)容改為“背景色”，點擊“確定”新建一個像素與待分析的區(qū)域相同的畫布(背景為黑色)；

②點選菜單欄的“編輯”-“粘貼”，將待分析的區(qū)域復(fù)制到新畫布上；

③選擇“鋼筆工具”，逐一對細(xì)胞壁進行精確勾勒，按“ESC”鍵完成勾勒；

④打開“路徑面板”，雙擊“路徑圖標(biāo)”，輸入路徑名稱，點擊“確定”保存路徑；

⑤選擇“畫筆工具”，在“畫筆工具欄”中將“大小”改為“4”像素，“硬度”改為“100％”；

⑥選擇“鋼筆工具”，右擊畫好的“路徑”，在彈出菜單中選擇“描邊路徑”，對話框中選擇“畫筆工具”，點擊“確定”，待分析區(qū)域清晰地顯示出胚乳細(xì)胞的輪廓；

⑦在“圖層面板”中右擊“背景圖層”，在彈出菜單中選擇“復(fù)制圖層”，點擊“確定”生成名稱為“背景副本”的圖層，拖動該圖層至最頂端，右擊“路徑”，在彈出菜單中選擇“描邊路徑”，對話框中選擇“畫筆工具”，點擊“確定”，顯示出背景為黑色，細(xì)胞輪廓為白色的圖像；

⑧點選菜單欄的“文件”-“存儲為”，保存為TIF格式的無損圖片。