[發明專利]一種醋酸普蘭林肽的制備方法

有效

• 申請號: 201410810773.6
• 申請日: 2014-12-23
• 公開（公告）號: CN104530214B
• 公開（公告）日: 2018-07-20
• 發明（設計）人: 謝義鵬;李元波;曹康平;王強;伍普華;袁森林;王穎
• 申請（專利權）人: 揚子江藥業集團四川海蓉藥業有限公司
• 主分類號: C07K14/575
• 分類號: C07K14/575;C07K1/20;C07K1/16;C07K1/10;C07K1/04
• 代理公司: 四川省成都市天策商標專利事務所 51213
• 代理人: 楊剛

1.一種醋酸普蘭林肽的制備方法，包括以下步驟：

1)Fmoc-Tyr(tBu)-Rink Amide-MBHA Resin氨基樹脂的制備

以Fmoc-Tyr(tBu)-OH和替代度為0.1～0.5mmol/g的Rink Amide-MBHA Resin氨基樹脂為起始原料，通過Fmoc固相合成法制備得到Fmoc-Tyr(tBu)-Rink Amide-MBHA Resin氨基樹脂；

2)全肽樹脂的合成

將所述Fmoc-Tyr(tBu)-Rink Amide-MBHA Resin氨基樹脂按照肽序在偶聯劑作用下依次偶聯除Tyr外剩余的每個氨基酸的保護氨基酸，每次偶聯一個氨基酸的保護氨基酸后形成新的氨基樹脂，將所述新的氨基樹脂在脫保護劑的作用下進行脫保護，再偶聯下一個氨基酸的保護氨基酸，以此循環至全部氨基酸連接完畢，得到全肽樹脂，其中所述保護氨基酸為連接有保護基團的氨基酸，所述脫保護為將所述保護基團從所述保護氨基酸上脫除的過程；

3)全肽樹脂的切割

將所述全肽樹脂通過裂解液進行裂解，制得普蘭林肽的中間肽；

4)中間肽的環化

通過空氣氧化法在所述中間肽的內部構建出二硫醚鍵，得到粗肽，所述空氣氧化法為將中間肽溶入純水后形成混合液，將混合液經過PH調節后暴露在空氣中自然氧化的方法；

5)初步純化

通過反相高效液相色譜法對所述粗肽進行初步純化，得到純化肽；

6)精制

通過流動相中含有體積百分濃度為0.1％的醋酸溶液的反相高效液相色譜法對所述純化肽進行轉鹽與精制，即得到醋酸普蘭林肽，其中所述轉鹽是指純化肽與醋酸溶液反應得到普蘭林肽的醋酸鹽；

所述步驟2)中所述的偶聯劑為HOBT、DIC與DMF的混合溶液，其與步驟1)中所述的RinkAmide-MBHA Resin氨基樹脂的摩爾比為1:1～5:1，其中HOBT與DIC的摩爾比為1:1；

所述步驟2)中所述的每個氨基酸的保護氨基酸與步驟1)中所述的Rink Amide-MBHAResin氨基樹脂的摩爾比為1:1～5:1；

所述步驟3)中所述裂解液為體積比為85：10：5的TFA、EDT與H₂0相混合的混合溶液，其用量為：所述裂解液的體積與所述全肽樹脂的質量的比為15:1～5:1；

所述步驟4)中所述的空氣氧化法的過程為：將中間肽溶入純水后形成混合液，使用氨水將混合液PH值調至中性附近，再將其暴露在空氣中于室溫下自然氧化1～2天，其后使用醋酸將PH值調節至3～5；

所述步驟5)中所述反相高效液相色譜法中使用10μm的C8反相色譜柱，由體積百分濃度為0.1％的三氟乙酸溶液作為極性流動相中的A相，由乙腈作為極性流動相中的B相，所述A相與B相混合作為洗脫劑。

2.根據權利要求1所述的醋酸普蘭林肽的制備方法,其特征在于：所述步驟2)中所述的脫保護劑為體積百分濃度為10～40％的哌啶的DMF溶液，其用量為：所述哌啶的DMF溶液的體積與所述Rink Amide-MBHA Resin氨基樹脂的物質的量之比為30:1～10:1，其中哌啶的DMF溶液是指將哌啶溶解于DMF中形成的溶液。

3.根據權利要求2所述的醋酸普蘭林肽的制備方法,其特征在于：所述步驟5)中所述反相高效液相色譜法包括以下步驟：

(1)以所述三氟乙酸溶液平衡10μm的C8反相色譜柱，其后取所述粗肽進樣，并采用所述三氟乙酸溶液對進樣后的粗肽進行沖洗；

(2)對完成步驟(1)的粗肽進行梯度洗脫，所述洗脫劑中乙腈的體積百分比從30％不斷上升至35％，以215nm的波長檢測色譜，觀察色譜中主峰的出現情況，當主峰出現時，開始收集產物；

(3)對主峰峰頂出現前、峰頂附近、峰頂出現后的產物分段收集，至無雜峰出現時結束收集；

(4)對步驟(3)中收集到的峰頂出現前、峰頂出現后的產物進行濃縮并對濃縮后產生的粗肽重復步驟(1)至步驟(3)的過程多次；

(5)對步驟(3)與步驟(4)中收集到的峰頂附近的產物進行合并與旋轉濃縮，即得到所述純化肽。