[發明專利]一種高效價胰蛋白酶

在審

• 申請號: 201410807828.8
• 申請日: 2014-12-23
• 公開（公告）號: CN104531651A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發明（設計）人: 劉乃山;王議鋒;劉翠珍
• 申請（專利權）人: 青島康原藥業有限公司
• 主分類號: C12N9/76
• 分類號: C12N9/76
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域

本發明屬于生物制藥領域，涉及藥用胰蛋白酶的分離純化技術。具體地說是采用鹽析、多重結晶結合透析等技術來提取胰蛋白酶。

背景技術

胰蛋白酶是從牛胰腺或豬胰腺中分離純化得到的一種蛋白酶。它主要的功用有：能使膿、痰液、血凝塊等分解、變稀，易于引流排除，加速創面凈化，促進肉芽組織新生，此外還有抗炎癥作用。臨床上用于膿胸、血胸、外科炎癥、潰瘍、創傷性損傷、瘺管等所產生的局部水腫、血腫及膿腫等。噴霧吸入，用于呼吸道疾病。也可用于治療毒蛇咬傷。還常用于動物細胞培養前對組織的處理。

糜蛋白酶和胰蛋白酶都是典型的絲氨酸蛋白酶，二者的性質極為相似，不易分開，但是對蛋白質的專一性卻各異。胰蛋白酶至作用于堿性氨基酸L-精氨酸或賴氨酸的所及所構成的C-末端肽鍵，而糜蛋白酶則選擇性地水解由芳族或脂族氨基酸（如苯丙氨酸、絡氨酸）所組成的肽鍵。胰蛋白酶能選擇性地水解蛋白質中賴氨酸或精氨酸的羧基端肽鍵，能消化溶解變性蛋白質，對未變性的蛋白質無作用，因此，對活細胞的蛋白質以及有活性的消化酶不起作用。

目前市場上都在致力于高純度蛋白的開發和應用，來替代普通的低純度產品，以克服普通低純度產品中的雜蛋白造成的過敏反應。用傳統的方法僅提取胰蛋白酶是相當困難的。2006年7月上海阿敏制藥有限公司公開了一種糜胰蛋白酶的制備方法（200610023582.0），其采用低溫酸提、梯度鹽析、冰水透析、親和層析、乙醇醇析的產品工藝，得到糜胰蛋白酶。2011年1月馬忠仁等申請了一種提取糜胰蛋白酶的方法（200910170682.X），其采用了CaCl2激活糜胰蛋白酶原成為糜胰蛋白酶的同時加入飽和度的（NH4）2SO4，使其生成硫酸鈣沉淀吸附糜胰蛋白酶，經過洗脫、鹽析、超濾和凍干獲得白色的糜胰蛋白酶的凍干粉末。產品均為糜胰蛋白酶，沒有單純的胰蛋白酶提取分離純化。

發明內容

本發明的目的就是為了生產高效價的胰蛋白酶而又降低生產成本，對傳統工藝加以改造，尤其是參數的改造，生產了一種高效價的胰蛋白酶。

本發明的技術方案是：利用硫酸溶液將胰腺細胞中含有的酶原提取出來，然后根據等電點沉淀的原理，調節pH，硫酸銨分級鹽溶、鹽析將胰蛋白酶原等沉淀析出，再將胰蛋白酶粗品溶解后，經鹽溶、鹽析，再用活性胰蛋白酶激活，被激活的酶溶液再經結晶透析、凍干的方法，即可得較高純度的胰蛋白酶，包括如下步驟：

1、胰蛋白酶粗制生產操作：

（1）提取工序：將新鮮的胰臟絞碎成胰漿，稱重。按每千克胰漿加入2~3L的0.1~0.2mol/L硫酸溶液，浸漬20~28小時，將浸漬物置濾袋過濾，濾干后棄去濾渣，留取濾液；

（2）鹽溶工序：浸漬液中加入硫酸銨，達到30~50%飽和度，靜置10~16小時，過濾，留取濾液；

（3）鹽析工序：濾液中加入硫酸銨，達到50~80%飽和度，靜置10~16小時，過濾，留取濾餅；

（4）每克濾餅加入2~5ml的水溶解，重復上述（2）、（3）操作；

（5）每克濾餅用1~3ml的水溶解，然后每克濾餅中加入0.1~1ml的飽和硫酸銨溶液，調節pH至4.0~6.0；

（6）結晶工序：溶液在20~30℃溫度中靜置24~72小時，有針狀糜蛋白酶結晶析出；離心，調節pH至2.0~5.0，每1000ml溶液中加300~400g固體硫酸銨，達到50~80%飽和度，靜置12~16小時，抽濾；

（7）干燥工序：取沉淀物，干燥，即得胰蛋白酶粗品。

2、胰蛋白酶精制生產操作：

（1）投料：稱取胰蛋白酶粗品，按每克胰蛋白酶粗品加2～4ml的水攪拌溶解，調節pH至3.0±0.5，以助其溶解，攪拌10～16小時；計量溶液體積，按400～500g/L比例加入固體硫酸銨，待其溶解后，靜置沉淀10～16小時；

（2）鹽溶：將溶液過濾，稱量濾餅重量，先按每克濾餅加入2~4ml的水，攪拌溶解后，調節pH至3.0±0.4，再按每克濾餅加入1～3ml的飽和硫酸銨溶液靜止沉淀10～16小時；

（3）鹽析：將溶液過濾，量取濾液體積，加入等體積量的飽和硫酸銨溶液，靜置沉淀10～16小時；

（4）洗鎂：將上清液棄去，沉淀物真空抽濾，并在濾餅上加入飽和硫酸鎂溶液，靜置1分鐘，抽濾，待濾液開始流出，將漏斗上剩余的硫酸鎂溶液傾去，將濾餅取出稱重，待活化；