[發明專利]一種高效價胰蛋白酶

在審

• 申請號: 201410807828.8
• 申請日: 2014-12-23
• 公開（公告）號: CN104531651A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發明（設計）人: 劉乃山;王議鋒;劉翠珍
• 申請（專利權）人: 青島康原藥業有限公司
• 主分類號: C12N9/76
• 分類號: C12N9/76
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

1.一種高效價胰蛋白酶，其特征在于是由以下方法制備而成：（1）原料絞碎，抽提酶原；（2）分級鹽溶、鹽析；（3）結晶，得胰蛋白酶粗品；（4）粗品投料，多重結晶；（5）活化；（6）結晶；（7）透析；（8）凍干。

2.根據權利要求1所述，其特征在于，各步驟具體為：

（1）提取：將動物的胰臟絞碎成胰漿，用硫酸溶液浸漬，過濾，留取濾液；

（2）鹽溶、鹽析：濾液中加入硫酸銨，使硫酸銨的飽和度達到30-50%，靜置，過濾，留取濾液；濾液中加入硫酸銨，使硫酸銨的飽和度達到50-80%，靜置，過濾，留取濾餅；所得濾餅加水溶解，加入飽和硫酸銨溶液，調節pH值至4.0-5.5；

（3）結晶：溶液靜置至有針狀糜蛋白酶結晶析出；離心，調節pH值至2.0-5.0，在溶液中加入固體硫酸銨，抽濾；取沉淀物，干燥，即得胰蛋白酶粗品；

（4）投料：取胰蛋白酶粗品，加水溶解，調節pH，攪拌；?加入硫酸銨，溶解，靜置；過濾，濾餅加水，攪拌溶解，調節pH，加入飽和硫酸銨溶液，靜置；過濾，濾液中加入飽和硫酸銨溶液，靜置；洗鎂，待活化；

（5）活化：將濾餅溶于鹽酸溶液，加入氯化鈣溶液及硼酸緩沖液，再加水，調節pH，最后加入結晶胰蛋白酶進行活化，將溶液靜置；

（6）結晶：將活化后的溶液調節pH，加入固體硫酸銨，攪拌溶解，靜置，過濾，濾液加入固體硫酸銨，靜置，過濾，得濾餅；濾餅中加入硼酸緩沖液，調節pH，攪拌均勻，再將溶液裝透析袋，浸于外透液中；

（7）透析：過濾得結晶物，加水溶解，調節pH；將溶液透析，去除雜質；

（8）凍干：取出透析液，抽濾，得濾液，調節pH，凍干后得結晶胰蛋白酶成品。

3.根據權利要求2所述的一種高效價胰蛋白酶制備工藝，其特征在于，步驟（1）中，所述動物胰臟為新鮮的牛胰臟、新鮮的豬胰臟；硫酸溶液的濃度為0.1~0.2mol/L?；胰漿與硫酸溶液的重量比為1：2~1：3；浸漬時間是20~28小時。

4.根據權利要求2所述的一種高效價胰蛋白酶制備工藝，其特征在于，所述步驟（2）中，水與濾餅的重量比為1：1~3：1；調節pH值至4.0~6.0；加入的飽和硫酸銨溶液與濾餅的重量比為1：10~1：1。

5.根據權利要求2所述的一種高效價胰蛋白酶制備工藝，其特征在于，所述步驟（3）中溶解靜置環境溫度為20~30℃；調節pH值至2.0~5.0；每1000ml溶液中加入固體硫酸銨的重量為300~400g。

6.根據權利要求2所述的一種高效價胰蛋白酶制備工藝，其特征在于，步驟（4）中,胰蛋白酶粗品與水的重量比為1：2-1：4，調節pH至3.0±0.５，攪拌10～16小時；每升溶液加入400～500g固體硫酸銨，待其溶解后，靜置沉淀10～16小時。

7.根據權利要求2所述的一種高效價胰蛋白酶制備工藝，其特征在于，步驟（5）中，稱濾餅重量，加0.001～0.01mol/L鹽酸溶液將濾餅溶解，加入0.5～2mol/L氯化鈣溶液，以及pH7.5～8.5的硼酸緩沖液，再加入水，調節pH7.0～8.0，最后每克濾餅加5～15mg的結晶胰蛋白酶進行活化處理，pH值控制在7.0～8.0；所述鹽酸溶液的加入量為濾餅重量的3～5倍，所述氯化鈣溶液的加入量為濾餅重量的1～3倍，所述硼酸緩沖液的加入量為濾餅重量的4～6倍。

8.根據權利要求2所述的一種高效價胰蛋白酶制備工藝，其特征在于，步驟（6）中，活化后的溶液調節pH至3.0±0.4，再按200～300g/L加入固體硫酸銨，攪拌溶解，在0～10℃中存放32～60小時使硫酸鈣沉淀，過濾，濾液中按150～250g/L加入固體硫酸銨，0～10℃時放置10～14小時，過濾，得濾餅；按每克濾餅加入1～2mlpH8.0～10.0硼酸緩沖液，調節pH至8.0±0.4，攪拌均勻，再將溶液裝透析袋，浸于外透液中，溫度控制在0～10℃。

9.根據權利要求2所述的一種高效價胰蛋白酶制備工藝，其特征在于，步驟（7）中，按每克結晶物加入1～3ml水溶解，調節pH至3.0±0.5，溫度控制在0～10℃，透析2～4天。

10.根據權利要求2所述的一種高效價胰蛋白酶制備工藝，其特征在于，步驟（8）中，調節pH至6.0±0.4。