[發明專利]一種疏水色譜純化激肽釋放酶的方法

在審

• 申請號: 201410807827.3
• 申請日: 2015-08-03
• 公開（公告）號: CN104498460A
• 公開（公告）日: 2015-07-29
• 發明（設計）人: 劉冠男;林曉磊;孫延年
• 申請（專利權）人: 青島康原藥業有限公司
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地說涉及一種應用疏水色譜純化激肽釋放酶的方法。

背景技術

激肽釋放酶屬于絲氨酸蛋白酶，它包括血漿型激肽釋放酶和組織型激肽釋放酶兩種類型，分子量分別為25200道爾頓和33800道爾頓，均能使激肽原釋放出一種多肽——激肽，而激肽釋放酶－激肽系統（kallikrein?kinin?system，KKS）是體內主要的降壓系統之一，作為一個復雜的內源性多酶系統，參與調控心血管、腎臟、神經系統等的生理功能，與心臟病、腎病、炎癥反應、癌癥等疾病的發生有著密切關系。

近年來在心血管系統方面的研究進展很快，許多臨床研究和基礎實驗已證實糖尿病、高血壓、心力衰竭、心肌梗死及左心室肥厚等疾病的發生與KKS的活性降低有關。因而深入研究KKS的作用為研究心血管相關疾病的發病機制和治療手段提供了又一新的途徑。

本發明人自2008年開始對胰酶的生產工藝進行試驗研究，特別是在糜蛋白酶原和胰蛋白酶原的生產過程中，不斷探索，力求優化完善工藝參數，并且在原有工藝的基礎上另辟蹊徑，成功完成提取激肽釋放酶原的工藝研究，其收率為0.2%～0.4%，生產工藝穩定，質量可控。

發明內容

本發明提供了一種疏水色譜純化激肽釋放酶的方法，通過疏水色譜等生物分離工程技術純化激肽釋放酶，較好的保持蛋白活性。

一種疏水色譜純化激肽釋放酶的方法，其特征在于：采用疏水色譜等現代生物分離技術，將激肽釋放酶效價提高到1500～1800iu/mg，更好的保持了蛋白的活性。在發明技術方案中，其特征還在于所述提取工藝包括如下步驟：

1）?離子交換層析

1.1）將激肽釋放酶原用0.001-0.01mol/L，PH3-6的醋酸緩沖液溶解離心，上清液加入離子交換樹脂，攪拌、吸附，收集樹脂，漂洗直至無泡沫；

1.2）再用0.01-0.3mol/L，PH3-8的0.1-5mol/L，PH5-10的NaCL溶液攪拌洗脫樹脂，分離樹脂得洗脫液；

2）鹽析

調節洗脫液pH值至3.0～5.0，加入固體硫酸銨，靜置過夜，次日過濾，收集濾餅；

3）超濾

加入濾餅重量15倍量的（w/v）磷酸鹽緩沖液，攪拌，調節pH值至7.0～9.0，待液體超濾，體積控制在3/10；

4）熱原處理

4.1）取超濾液，按50：5：3的比例，先后加入磷酸鈉溶液和醋酸鈣溶液；

4.2）調節pH值至8.0～10.0，攪拌，離心，棄去沉淀物，取濾液，準備透析扎包；

5）透析工序

取濾液，透析液扎包，放入純化水中，進行透析交換，透析4～6天；

6）疏水色譜

6.1）用適量的含0.5-3mol/L?(NH₄)₂SO₄的0.01-0.3mol/L，PH3-8的NaAc-HAc緩沖液來平衡疏水色譜快膠柱；

6.2）將透析液流經此柱，流速控制在1~5mL/min左右；

6.3）平衡后，用0.5-3mol/L?的(NH₄)₂SO₄溶液洗脫至蛋白檢測儀顯示至基線；

6.4）再用不含(NH₄)₂SO₄平衡緩沖液洗脫，收集含激肽釋放酶活性峰的洗脫液，-20℃保存；

7）凍干

調節pH值至5.5～6.5，裝盤、凍干，得激肽釋放酶。

經檢測，所得激肽釋放酶效價約為1500～1800iu/mg。

與現有技術相比，本發明的優點和積極效果是：

選用疏水色譜等現代生物分離技術純化激肽釋放酶,可以使其理化性質和生物活性在后續生產過程中保持穩定，最終使激肽釋放酶的各項指標均符合中國藥典標準。更重要的是，通過工藝的不斷改進和完善，使得激肽釋放酶效價提高到1500～1800iu/mg，節約成本，提高了經濟效益。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，而不以任何方式限制。

實施例1

1）離子交換層析

1.1）將激肽釋放酶原20kg用0.005mol/L，PH4的醋酸緩沖液100L溶解離心，上清液加入離子交換樹脂，攪拌吸附2h，收集樹脂，漂洗直至無泡沫；

1.2）再用0.03mol/L，PH5的NaCL溶液150L攪拌洗脫樹脂1h，分離樹脂得洗脫液138L；