[發明專利]一種原料乳中乳過氧化物酶的試紙檢測方法

在審

• 申請號: 201410798199.7
• 申請日: 2014-12-19
• 公開（公告）號: CN104406977A
• 公開（公告）日: 2015-03-11
• 發明（設計）人: 姜瞻梅;許曉曦;車紅霞;劉麗麗;辛巖
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;馬鑫

技術領域

本發明涉及生化檢測領域，具體涉及一種原料乳中乳過氧化物酶的分析測試方法。

背景技術

乳過氧化物酶(Lactoperoxidase,LP)是過氧化物酶類的一種，由一條多肽鏈構成，包括612個氨基酸殘基，分子量大約是78kDa,該酶是一個依賴于過氧化氫(H₂O₂)的氧化還原酶類，作為乳液中的內源酶之一，廣泛存在于哺乳動物的乳腺、唾液腺、淚腺及其分泌物中。在牛乳中，LP是含量僅次于黃嘌呤氧化酶的酶，它在乳中的濃度大約是30mg/L。LP熱穩定性相對較高，de?Wit等發現牛奶中LP徹底失活，需要在78℃持續15s；Marks等證明了普通的巴氏滅菌法并不能使牛奶中的LP失活，經72℃持續15s的巴氏滅菌后仍有活性。因此，可通過檢測LP活力，掌握乳品的熱處理情況。

國內外對乳過氧化物酶檢測的研究較多，ABTS、TMB、愈創木酚等常用于檢測LP。現有的檢測方法都是借助大型儀器測定酶活性與酶濃度，方法的準確度、靈敏度均較高，但由于需借助大型儀器，不適合于現場檢測。目前，鑒于乳過氧化物酶的儀器檢測方法，需對樣品進行復雜前處理且處理時間長、無法實現在線檢測等缺點。因此，開發快速、靈敏、準確檢測乳過氧化物酶含量的關鍵技術，用于原料乳驗收及其乳制品加工，具有重要理論研究價值和實際意義。本發明利用酶促顯色反應原理，利用四甲基聯苯胺(TMB)為顯色底物，優化檢測試紙的最佳制備條件，研制出一種簡便、快速、精確的乳過氧化酶試紙檢測方法，以滿足實際現場快速檢測乳過氧化酶的加工需求。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有的乳過氧化物酶含量的分析測試方法中存在的操作繁瑣且需要專業的技術人員進行操作、或成本高、或無法實現在線檢測等問題，提供一種快速、便捷的乳過氧化物酶的檢測方法。

實現上述目的的本發明的技術方案為：

一種原料乳中乳過氧化物酶的試紙檢測法，該方法包括以下步驟：

(1)配制試紙浸泡液：分別配制pH值為4.0～6.0的0.1mol/L檸檬酸-0.2mol/L磷酸氫二鈉緩沖溶液、濃度為10-25mmol/L的TMB溶液以及質量分數為0.1％-1.0％的表面活性劑溶液；將上述配制好的三種溶液按照緩沖溶液：TMB溶液：表面活性劑溶液體積比＝30-50:0.5-2:1-3，優選按照體積比40:1:2混合混勻，即為試紙浸泡液；

(2)配制過氧化氫(H₂O₂)溶液：配制濃度為0.5-1.0mmol/L的H₂O₂溶液；

(3)試紙的制作：將裁剪好的濾紙條在步驟(1)配制的試紙浸泡液中，浸泡1～3分鐘，完全浸透后，放在平皿上抽真空干燥，制得乳過氧化物酶檢測試紙，為提高試紙的穩定性，干燥后的試紙裁去邊緣0.5cm，將處理好的顯色試紙切割成規格為0.2-0.8cm×0.2-0.8cm的試紙片，作為反應區黏接在準備好的PVC膠版上，即制成乳過氧化物酶檢測試紙；

(4)試紙檢測：在步驟(3)中制備好的檢測試紙上，先滴加3μL步驟(2)配制好的H₂O₂溶液，再滴加3μL待檢測乳樣品，反應1-7min后，目測或使用便攜式光電測色儀或其他任何可采集樣品顏色信息的儀器，記錄試紙顏色信息變化；

(5)標準的建立：配制濃度范圍在0-25mg/L的標準乳過氧化物酶樣品，按照步驟(4)的方法，采用測定吸光度值或與之等效的方法，制作標準比色卡，或建立反應過程中的顏色變化信息與乳過氧化物酶濃度之間固定的函數關系，作為檢測標準；

(6)檢測：將步驟(4)采集的顏色變化信息與步驟(5)獲得的檢測標準進行比較，獲得所測乳樣中的乳過氧化物酶的濃度。

在本發明所述的方法中，優選的，步驟(1)所述的0.1mol/L檸檬酸-0.2mol/L磷酸氫二鈉緩沖液pH值為5.0。

在本發明所述的方法中，優選的，步驟(1)所述的TMB溶液濃度為22mmol/L。

在本發明所述的方法中，優選的，步驟(1)所述的表面活性劑為Tween-20、Triton、CTAB或SDS中的至少一種。更優選的，步驟(1)所述的表面活性劑為質量分數為0.5％的Tween-20或質量分數為0.3％的CTAB。

在本發明所述的方法中，優選的，步驟(2)所述的H₂O₂濃度為0.6mmol/L。