[發明專利]一種用于檢測番茄斑萎病毒的NASBA方法

有效

• 申請號: 201410798148.4
• 申請日: 2014-12-21
• 公開（公告）號: CN104404173A
• 公開（公告）日: 2015-03-11
• 發明（設計）人: 吳興海;陳長法;封立平;王簡;尼秀媚;王英超;張云霞;余冬冬
• 申請（專利權）人: 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

技術領域

本發明屬于植物病原檢測技術領域，具體涉及一種用于檢測番茄斑萎病毒的NASBA方法。

背景技術

近年來，番茄斑萎病毒(Tomato?spotted?wilt?virus，TSWV)以其廣泛的寄主范圍和造成的巨大經濟損失已被列為世界危害最大的十種植物病毒之一。在20世紀60～80年代，該病毒曾在歐美及非洲的煙草和番茄上大流行，每年的發病率為20％～50％，造成高達數10億美元的損失。在美國夏威夷、巴西、意大利和南非，TSWV在20世紀80～90年代的流行曾導致番茄、萵苣等作物近乎絕產。近年來，番茄斑萎病毒屬病毒特別是TSWV，已成為全世界引起多種經濟作物和觀賞植物極大經濟損失的重要因子。

我國目前種植的辣椒、洋蔥、生菜等蔬菜種子很多來自于世界各地，尤其是番茄種子基本依賴進口，進口國別包括美國、日本、荷蘭、泰國等國，這些進口國目前都有番茄斑萎病毒的發生與報道，我國口岸曾于2012年在進境的種子中截獲TSWV病毒。而傳統的TSWV檢測及確證方法一般通過生物寄主、形態學試驗判定植株是否具有植物病毒，這些方法費時，操作繁瑣，不能滿足病害防治的需要。

目前針對該病毒的檢疫鑒定主要局限在電鏡技術、血清學技術以及RT-PCR等傳統檢測技術，如ELISA方法，分子雜交，熒光定量PCR方法，普通PCR方法等等，但在這些方法中，血清學、雜交技術檢測靈敏度低，操作步驟繁瑣，周期長；電鏡、熒光PCR技術依賴大型儀器，因此很多實驗室在儀器配置和檢測能力上無法達到要求。另外，由于番茄斑萎病毒為單鏈RNA病毒，易于降解，以上方法操作的復雜性與靈敏度限制了對該病的檢測與預報。應用PCR技術檢測雖然靈敏，但目前的檢測實踐表明經常出現檢測假陽性或假陰性。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于檢測TSWV的NASBA方法，即利用具有高靈敏性和特異性的引物引導，在含有T7RNA聚合酶、RNAseH、反轉錄酶AMV、NTP、dNTP及反應緩沖液所組成的反應體系中，通過連續均一的體外特異性酶促反應實現核苷酸序列的等溫擴增，對樣品中的番茄斑萎病毒進行準確的檢測。

本發明首先提供一種用于檢測TSWV的NASBA引物，其引物序列分別為SEQ?ID?NO:1～2。

NA-P1:5′-aattctaatacgactcactatagggagTGTCAGTGGCTCCAATCCTG-3′

NA-P2:5′-aattctaatacgactcactatagggagGCTTTGTTGACACAAGGCAAAG-3′。

本發明還提供一種檢測TSWV的試劑盒，包含有如下的組分

1)NASBA擴增反應液A：

每25μL包括10×AMV?buffer?2.5μl，6.25mmol/L?NTPs?3μL，10mmol/L?dNTPs?1.5μL，10μmol/L引物NA-P1、NA-P2各0.5μL，雙蒸水9ml；

其中10×AMV?buffer為含40mmol/L?PH8.5的Tris-HCL，70mmol/L?KCL，12mmol/L?MgCL₂，5mmol/L?DTT的緩沖液；

2)NASBA擴增反應液B:

所述的NASBA擴增反應液B包含有：0.5U?RNaseH，32U?T7RNA聚合酶，6.4U?AMV反轉錄酶，2μL?DMSO，0.1μL1mol/L二硫蘇糖醇，0.25μL?10mg/mL?BSA，20U?RNA酶抑制劑，

上述的試劑盒用于檢測TSWV，包含有如下的步驟：

1)樣品RNA的提取

A、取0.1g樣品，加液氮研磨成粉末狀，將研磨物迅速移入1.5mL離心管中，加入1mL?Trizol?Reagent，顛倒混勻，2℃～8℃，12000g，離心10min；

B、取上清，15℃～30℃，放置5min；加入0.2mL氯仿，用手劇烈震蕩(勿渦旋振蕩)，約15s，15℃～30℃，放置2min～3min；2℃～8℃，12000g，離心15min；

C、吸取600μL的上層水相，加500μL異丙醇混合上清液，15℃～30℃，放置10min；2℃～8℃，12000g，離心10min；

D、去除上清液，沉淀中加入1mL?75％乙醇，洗滌；2℃～8℃，7500g，離心5min；

E、去除上清液，沉淀自然干燥后，將其溶于30μL～50μL無RNase的水中，即為待檢模板RNA；

2)進行TSWV的NASBA擴增