[發明專利]一種用于檢測番茄斑萎病毒的NASBA方法

有效

• 申請號: 201410798148.4
• 申請日: 2014-12-21
• 公開（公告）號: CN104404173A
• 公開（公告）日: 2015-03-11
• 發明（設計）人: 吳興海;陳長法;封立平;王簡;尼秀媚;王英超;張云霞;余冬冬
• 申請（專利權）人: 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

1.一種檢測番茄斑萎病毒的NASBA擴增引物對，其特征在于，所述的引物對的上游引物、下游引物的序列分別為SEQ?ID?NO:1～2。

2.權利要求1所述的引物對在檢測植物樣品中番茄斑萎病毒的應用。

3.一種檢測番茄斑萎病毒的NASBA擴增試劑盒，包括如下組分：

1)NASBA擴增反應液A：

每25μL包括10×AMV?buffer?2.5μl，6.25mmol/L?NTPs?3μL，10mmol/L?dNTPs?1.5μL，10μmol/L引物NA-P1、NA-P2各0.5μL，雙蒸水9ml；其中引物NA-P1、NA-P2為權利要求1所述的上游引物、下游引物；

其中10×AMV?buffer為含40mmol/L?PH8.5的Tris-HCL，70mmol/L?KCL，12mmol/L?MgCL₂，5mmol/L?DTT的緩沖液；

2)NASBA擴增反應液B:

所述的NASBA擴增反應液B包含有：0.5U?RNaseH，32U?T7RNA聚合酶，6.4U?AMV反轉錄酶，2μL?DMSO，0.1μL1mol/L二硫蘇糖醇，0.25μL?10mg/mL?BSA，20U?RNA酶抑制劑。

4.權利要求3所述的試劑盒在檢測植物樣品中番茄斑萎病毒的應用。

5.一種使用權利要求3所述的試劑盒檢測植物樣品中番茄斑萎病毒的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步驟：

1)樣品RNA的提取

A、取0.1g樣品，加液氮研磨成粉末狀，將研磨物迅速移入1.5mL離心管中，加入1mL?Trizol?Reagent，顛倒混勻，2℃～8℃，12000g，離心10min，

B、取上清，15℃～30℃，放置5min；加入0.2mL氯仿，用手劇烈震蕩，約15s，15℃～30℃，放置2min～3min；2℃～8℃，12000g，離心15min，

C、小心吸取約為600μL的上層水相，勿擾動中間相和下層相，加500μL異丙醇混合上清液，15℃～30℃，放置10min，2℃～8℃，12000g，離心10min；

D、去除上清液，沉淀中加入1mL?75％乙醇，洗滌；2℃～8℃，7500g，離心5min；

E、去除上清液，沉淀自然干燥后，將其溶于30μL～50μL無RNase的水中，即為待檢模板RNA；

2)進行TSWV的NASBA擴增

A、在裝有14μL環介導等溫擴增反應液A的反應管中加入3μL待檢模板RNA，

B、在DNA擴增儀或水浴鍋上65℃溫浴5min，立即轉入41℃溫浴5min，；

C.在反應管中迅速加入4μL反應液B；

D.于41℃溫育2h；

E.將金屬浴調到4℃中止反應，3min后取出；

3)電泳檢測

取3g瓊脂糖，于100mL電泳緩沖液中加熱，充分溶化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0.5μg/mL，制膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠；將3μL～6μL?PCR擴增產物分別和適量加樣緩沖液混合，點樣；9V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠中部；紫外檢測儀下觀察電泳結果并記錄。