[發明專利]一種發夾型DNA探針及其定量檢測凝血酶的方法

有效

• 申請號: 201410794554.3
• 申請日: 2014-12-19
• 公開（公告）號: CN104569424A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 高文華;黃曉鵬;陳耀文;陳漢佳;張歆
• 申請（專利權）人: 汕頭大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/64;C12N15/115
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 溫旭;張澤思

技術領域

本發明涉及分析化學與分子生物學光譜分析領域，尤其涉及一種發夾型DNA分子探針的設計以及該探針在凝血酶檢測中的共振光散射技術應用。

背景技術

凝血酶（thrombin）是一種重要的多功能活性蛋白，在許多的生理學和病理學過程中，如血凝固、血栓癥、炎癥、血管新生、腫瘤生長和轉移等都發揮著關鍵的作用。對于一些與異常血液凝固有關的疾病，如肺部轉移性腫瘤等，凝血酶也可以被用作治療劑和生物標記物。如今在臨床分析上，蛋白質檢測手段主要依賴抗體的使用。盡管常見的檢測手段也可以實現凝血酶的定量檢測，但仍然存在一些如需要酶標記、使用放射性物質、過程耗時和使用復雜的儀器設備等各種不方便之處。基于此，發展一種新的，同時兼有選擇性和簡便性的檢測蛋白質方法顯得尤為重要。

適配體是一種能與不同的目標物，如蛋白質或藥物產生特異性結合的單鏈DNA或RNA分子。與傳統上的復雜的分子識別體系相比，適配體由于其易于合成受到越來越多的關注和研究。同時，其具有的出色的穩定性，廣泛的適用性和突出的選擇性等優點都使適配體成為在醫學診斷，環境監測和生物分析上的一種非常理想的分析工具。

發夾型DNA（H-eTBA）由于具有莖環結構，因此其在雜交過程中擁有很高的特異性。該性質使得發夾型DNA很容易地將與其互補DNA鏈中的單點突變或不匹配的DNA片段識別出來。也就是說，發夾型DNA結構能被用于提高基于DNA探針設計的傳感器的選擇性。

亞甲基藍（MB）是其中一種較為普遍的吩噻嗪類染料，其與單鏈（ss）和雙鏈（ds）DNA的靜電作用力不同。帶有正電荷的MB分子能通過靜電作用力積聚在帶負電荷的雙鏈DNA的雙螺旋結構表面。相反地，單鏈DNA與MB分子并不具備該性質。同時，MB與DNA分子的不同積聚程度還會影響體系的光譜學性質。顯然，MB分子這種對于單鏈和雙鏈DNA的獨特性質使其在基于DNA分子設計的蛋白質分析過程中可以作為一種指示物來應用。

共振光散射（RLS）技術是在1993年由Pasternack等提出的、在普通熒光分光光度計上進行的檢測技術，最早應用于生化分析中，因其具有簡便、快速、靈敏度高等一系列的優點，并被應用于其它領域，如：生化分析、藥物分析、納米材料等。共振光散射技術是利用光散射現象所建立的一種測試方法。共振光散射是一種彈性光散射，指的是當光束通過某種介質時，從入射光方向以外所觀察得到的現象，該現象廣泛地存在于光與粒子的作用當中。當介質中的電子受到光電磁波的電場振動，因此形成偶極振子，偶極振子從而向各個方向發射電磁波，即為光散射波。顯然，散射波會隨著介質粒徑大小而產生不同。光散射信號能夠很容易地通過傳統的熒光分光光度計，利用激發和發射波長的同步掃描來測定。

發明內容

本發明的目的在于提供一種發夾型DNA探針及其定量檢測凝血酶的方法解決現有技術存在的問題。

為了實現上述的目的，采用如下的技術方案：

一種發夾型DNA探針，具有莖環結構，內嵌有凝血酶適配體，其結構堿基序列如下：5’-GAATTC?TTAAA?GGTTGGTGTGGTTG?GAATTC-3’，?GGTTGGTGTGGTTG?G為所述凝血酶的適配體序列，5’-GAATTC和3’-CTTAAG所配對形成的部分為所述發夾型DNA莖環結構的莖部分，AATTC?TTAAA?GGTTGGTGTGGTTG?G為與CTBA互補的堿基序列。

一種發夾型DNA探針定量檢測凝血酶的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一，在Tris-HCl緩沖液體系中，將發夾型DNA溶液與不同濃度的凝血酶在37℃下恒溫反應25min；

步驟二，加入CTBA溶液，然后將混合溶液在37℃下繼續培育1?h；

步驟三，再加入亞甲基藍溶液，室溫下徹底混合反應；

步驟四，將溶液置于熒光分光光度計上，以相同的激發和發射波長，在225到700?nm的范圍內進行共振光散射掃描，得到共振光散射光譜以對凝血酶進行定量檢測。

進一步地，共振光散射掃描的激發光狹縫寬度為5?nm，發射光狹縫寬度為2.5?nm，掃描速率為1200?nm/min，光電倍增管電壓為400?V。

更進一步地，共振光散射光譜的線性范圍為凝血酶濃度0-630.6?μg/L，檢出限為11.74?μg/L。