[發明專利]一種發夾型DNA探針及其定量檢測凝血酶的方法

有效

• 申請號: 201410794554.3
• 申請日: 2014-12-19
• 公開（公告）號: CN104569424A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 高文華;黃曉鵬;陳耀文;陳漢佳;張歆
• 申請（專利權）人: 汕頭大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/64;C12N15/115
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 溫旭;張澤思

1.一種發夾型DNA探針，具有莖環結構，其特征在于，內嵌有凝血酶適配體，其結構堿基序列如下：5’-GAATTC?TTAAA?GGTTGGTGTGGTTG?GAATTC-3’，?GGTTGGTGTGGTTG?G為所述凝血酶的適配體序列，5’-GAATTC和3’-CTTAAG所配對形成的部分為所述發夾型DNA莖環結構的莖部分。

2.按照權利要求1所述的發夾型DNA探針定量檢測凝血酶的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一，在Tris-HCl緩沖液體系中，將發夾型DNA溶液與不同濃度的凝血酶在37℃下恒溫反應25min；

步驟二，加入CTBA溶液，然后將混合溶液在37℃下繼續培育1?h；

步驟三，再加入亞甲基藍溶液，室溫下徹底混合反應；

步驟四，將溶液置于熒光分光光度計上，以相同的激發和發射波長，在225到700?nm的范圍內進行共振光散射掃描，得到共振光散射光譜以對凝血酶進行定量檢測。

3.根據權利要求2所述的檢測凝血酶的方法，其特征在于，步驟二所述CTBA溶液與所述發夾型DNA的堿基序列AATTC?TTAAA?GGTTGGTGTGGTTG?G互補。

4.根據權利要求2所述的檢測凝血酶的方法，其特征在于，步驟四所述共振光散射掃描，激發光狹縫寬度為5?nm，發射光狹縫寬度為2.5?nm，掃描速率為1200?nm/min，光電倍增管電壓為400?V。

5.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述共振光散射光譜的線性范圍為凝血酶濃度0-630.6?μg/L，檢出限為11.74?μg/L。

6.根據權利要求2-5所述的檢測凝血酶的方法，其特征在于，所述Tris-HCl緩沖液體系pH為7.40；所述發夾型DNA溶液濃度為10?μM；所述CTBA溶液濃度為10?μM；所述亞甲基藍溶液濃度為5×10^-5?M。

7.根據權利要求6所述的檢測凝血酶的方法，其特征在于，所述發夾型DNA在檢測前先95℃下反應10?min后自然冷卻到室溫。

8.根據權利要求2、3、4、5或7所述的檢測凝血酶的共振光散射方法，其特征在于，能辨別出對體系產生干擾的單鏈DNA的不同形式。

9.按照權利要求8所述的檢測凝血酶的共振光散射方法，其特征在于，所述產生干擾的單鏈DNA可為發生單堿基突變和其它變異的DNA片段。