[發(fā)明專利]一種裝甲CTLA-4基因的RNA標準物質(zhì)及其應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410794484.1
• 申請日: 2014-12-19
• 公開（公告）號: CN104531740A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發(fā)明（設計）人: 連文昌;阮潤生;黃麗萍;李劍
• 申請（專利權）人: 安特諾生物醫(yī)藥（廈門）有限公司
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/70;C12Q1/68
• 代理公司: 廈門市新華專利商標代理有限公司 35203
• 代理人: 朱凌

技術領域

本發(fā)明涉及一種裝甲CTLA-4基因的RNA標準物質(zhì)及其應用。

背景技術

?細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4（CTLA-4）是表達于激活T細胞表面，作為淋巴細胞激活的共刺激信號。在T細胞活化中起到負調(diào)節(jié)作用。它與淋巴細胞激活因子CD28起相反作用。但CTLA-4與CDA28分子在基因結(jié)構(gòu)、染色體定位、序列的同源性及基因表達等方面都十分相近。氨基酸上兩者有31%同源性。具有同樣的相同的受體B7分子。但CTLA4與B7結(jié)合親和力比CD28與B7親和力高10~20倍，這就說明只要在少量CTLA-4情況下，即可阻斷CD28與B7的結(jié)合，從而抑制T細胞活化。當阻斷CTLA-4時，可以增加T細胞的激活或增殖。2010年抗CTLA-4單克隆抗體被FDA批準應用于不可切除或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤。抗CTLA-4抗體針對免疫抑制檢驗點制備出針對腫瘤免疫只治療比較有效的抗腫瘤藥物。因此，對于CTLA-4的研究是抗腫瘤有效方法。那么首先就是對CTLA-4?因子核酸水平檢測。可以利用核酸檢測方法可以準確、快速、靈敏的判定CTLA-4核酸水平。從而對抗CTLA-4單克隆抗體藥物的應用提供核酸水平的參考依據(jù)，最終提高藥物療效，使之高效的治愈腫瘤。??

CTLA-4又稱CD152，位于染色體2號長臂33，CTLA-4基因編碼的蛋白質(zhì)有223個氨基酸，672個開放性閱讀框和4個外顯子。4個外顯子分別編碼一個引導序列、一個v區(qū)域、一個跨膜區(qū)域和一個胞質(zhì)尾區(qū)。利用CTLA-4外顯子上特異性CDS區(qū)可以檢測CTLA-4核酸的存在。作為核酸檢測CTLA-4的特異性靶點。目前國內(nèi)還沒有診斷CTLA-4核酸檢測試劑及質(zhì)控產(chǎn)品。因此，研制一種檢測CTLA-4核酸表達水平的質(zhì)控樣品和標準物質(zhì)，對于臨床檢測CTLA-4免疫因子表達情況具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術問題，在于提供一種裝甲CTLA-4基因的RNA標準物及其應用，該物質(zhì)具有穩(wěn)定性，無生物傳染性，可真實模擬病毒粒子結(jié)構(gòu)，耐核糖核酸酶等特性，可用于淋巴細胞CTLA-4基因mRNA水平檢測方法和試劑盒的陽性質(zhì)控物質(zhì)。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：

一種裝甲CTLA-4基因的RNA標準物質(zhì)，所述裝甲CTLA-4基因的RNA標準物質(zhì)由如下步驟制得：

步驟10、獲得用于CTLA-4核酸檢測的C基因序列片段，如序列表中SEQ?ID?NO.1?所示，所述C基因為CTLA-4基因中的一個片段；

步驟20、獲取包含MS2噬菌體成熟酶蛋白基因和衣殼蛋白基因的表達載體，具體過程如下：

根據(jù)MS2噬菌體基因序列，設計一對特異性引物，所述一對特異性引物如下：MCP1:5'-?CGGGGTACCCTAGGAGGTTTGACCTGTGCGAGC-3'；?MCP2:?5'-CGGGATCCGTTAGTAGATGCCGGAGTTT-3'?；預期擴增產(chǎn)物為MS2噬菌體的外殼蛋白和成熟酶蛋白基因，即CP基因，并引入雙酶切位點：KpnⅠ和BamHⅠ；分別雙酶切CP基因及PET32a載體，并將CP基因連接到PET32a載體上，最終得到PET32a-CP載體；所述CP基因序列如序列表中SEQ?ID?NO.４所示；

步驟30、CTLA-4?C基因和CP基因的表達載體的獲取，具體如下：

攜帶C基因的T載體，在Not?Ⅰ和BamH?Ⅰ雙酶切后，進行凝膠電泳后回收140bp小片段；同時進行PET32a-CP載體Not?Ⅰ和BamH?Ⅰ雙酶切，進行凝膠回收7115bp大片段，利用T4連接酶進行小片段和大片段連接，將C基因插入PET32a載體T7啟動子下游，獲得原核表達載體PET32a-CP-CTLA-4；

步驟40、原核表達載體PET32a-CP-CTLA-4轉(zhuǎn)入原核表達菌株BL21（DE3）PLySs中，誘導表達，采用冷凍低溫凍融，離心，純化后，獲得表達產(chǎn)物顆粒；

步驟50、將步驟40獲得的表達產(chǎn)物顆粒進行DNase?Ⅰ?消化，然后離心棄沉淀，保留上清；加入終濃度4M硫酸銨，沉淀表達產(chǎn)物，離心棄上清，獲得沉淀即是含有CTLA-4基因的表達產(chǎn)物，最后用1×TE溶液重懸，獲得含有CTLA-4?C基因RNA假病毒顆粒產(chǎn)物；

步驟60、將含有CTLA-4?C基因RNA假病毒顆粒產(chǎn)物用TE緩沖液稀釋，進行VP病毒顆粒OD值測定，依據(jù)OD值換算稀釋產(chǎn)物，獲得內(nèi)含CTLA-4基因RNA標準物質(zhì)，即裝甲CTLA-4基因的RNA標準物質(zhì)。