[發明專利]一種裝甲CTLA-4基因的RNA標準物質及其應用

在審

• 申請號: 201410794484.1
• 申請日: 2014-12-19
• 公開（公告）號: CN104531740A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發明（設計）人: 連文昌;阮潤生;黃麗萍;李劍
• 申請（專利權）人: 安特諾生物醫藥（廈門）有限公司
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/70;C12Q1/68
• 代理公司: 廈門市新華專利商標代理有限公司 35203
• 代理人: 朱凌

1.一種裝甲CTLA-4基因的RNA標準物質，其特征在于：所述裝甲CTLA-4基因的RNA標準物質由如下步驟制得：

步驟10、獲得用于CTLA-4核酸檢測的C基因序列片段，如序列表中SEQ?ID?NO.1?所示，所述C基因為CTLA-4基因中的一個片段；

步驟20、獲取包含MS2噬菌體成熟酶蛋白基因和衣殼蛋白基因的表達載體，具體過程如下：

根據MS2噬菌體基因序列，設計一對特異性引物，所述一對特異性引物如下：MCP1:5'-?CGGGGTACCCTAGGAGGTTTGACCTGTGCGAGC-3'?；?MCP2:?5'-CGGGATCCGTTAGTAGATGCCGGAGTTT-3'?；預期擴增產物為MS2噬菌體的外殼蛋白和成熟酶蛋白基因，即CP基因，并引入雙酶切位點：KpnⅠ和BamHⅠ；分別雙酶切CP基因及PET32a載體，并將CP基因連接到PET32a載體上，最終得到PET32a-CP載體；所述CP基因序列如序列表中SEQ?ID?NO.４所示；

步驟30、CTLA-4?C基因和CP基因的表達載體的獲取，具體如下：

攜帶C基因的T載體，在Not?Ⅰ和BamH?Ⅰ雙酶切后，進行凝膠電泳后回收140bp小片段；同時進行PET32a-CP載體Not?Ⅰ和BamH?Ⅰ雙酶切，進行凝膠回收7115bp大片段，利用T4連接酶進行小片段和大片段連接，將CDS基因插入PET32a載體T7啟動子下游，獲得原核表達載體PET32a-CP-CTLA-4；

步驟40、原核表達載體PET32a-CP-CTLA-4轉入原核表達菌株BL21（DE3）PLySs中，誘導表達，采用冷凍低溫凍融，離心，純化后，獲得表達產物顆粒；

步驟50、將步驟40獲得的表達產物顆粒進行DNase?Ⅰ?消化，然后離心棄沉淀，保留上清；加入終濃度4M硫酸銨，沉淀表達產物，離心棄上清，獲得沉淀即是含有CTLA-4基因的表達產物，最后用1×TE溶液重懸，獲得含有CTLA-4?C基因RNA假病毒顆粒產物；

步驟60、將含有CTLA-4?C基因RNA假病毒顆粒產物用TE緩沖液稀釋，進行VP病毒顆粒OD值測定，依據OD值換算稀釋產物，獲得內含CTLA-4基因RNA標準物質，即裝甲CTLA-4基因的RNA標準物質。

2.根據權利要求1所述的一種裝甲CTLA-4基因的RNA標準物質，其特征在于：所述步驟10中，C基因可以通過體外化學合成或RT-PCR擴增獲得，并連接入T載體，其中T載體含有Not?Ⅰ和BamH?Ⅰ酶切位點；所述C基因片段處于CTLA-4的CDS區域，所述RT-PCR擴增引物如下：

PrimerＬ：AGGGAAGTTTTGTGGAGGAGC；

PrimerＲ：GCACAATTCCACGCAATCA。

3.根據權利要求2所述的一種裝甲CTLA-4基因的RNA標準物質，其特征在于：所述步驟40具體如下：

將原核表達載體PET32a-CP-CTLA-4載體轉入原核表達菌BL21（DE3）PLySs，從中挑選出陽性克隆菌BL21（DE3）PLySs接種于含有氨芐青霉素的LB培養基中，進行誘導表達；最后離心，收集菌體沉淀，用TE緩沖液或PBS洗滌；再次收集沉淀完成后放入-20℃至-80℃度冰箱中隔4-6小時取出至溫室，反復3-4次，離心，向沉淀中加入1~20mg/ml溶菌酶緩沖液，25~37℃孵育20-60min，離心棄去沉淀，獲得表達產物顆粒。

4.根據權利要求3所述的一種裝甲CTLA-4基因的RNA標準物質，其特征在于：所述緩沖液為20mM?Tris?、0.2M?NaCl?、pH8.0。

5.權利要求1~4任一項所述的一種裝甲CTLA-4基因的RNA標準物質在免疫抑制因子CTLA-4核酸檢測中作為標準物質的應用。