[發明專利]一種納豆激酶活性測定方法

在審

• 申請號: 201410789569.0
• 申請日: 2014-12-18
• 公開（公告）號: CN104531833A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發明（設計）人: 張巖;傅亞琴;李楠;許勤虎
• 申請（專利權）人: 天津市百奧生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/37
• 分類號: C12Q1/37
• 代理公司: 天津市三利專利商標代理有限公司 12107
• 代理人: 李蕊

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其是一種納豆激酶活性測定方法。

背景技術

納豆(Natto)是日本傳統發酵食品，以大豆為原料由納豆芽孢桿菌發酵而成，其風味獨特、營養豐富。納豆激酶(NK)是納豆中的一種堿性絲氨酸蛋白酶，具有較強纖溶活性，因此常食納豆可減少血管栓塞的危險，有益于老年性心血管疾病的預防。

納豆激酶的活性反映了納豆的保健功效，納豆中的納豆激酶是直接分解血栓的纖維蛋白酶，具有強大的溶栓作用，比尿激酶的能力還要強，每克濕納豆溶栓效果相當于尿激酶1600FU，在胃腸中不失活。納豆激酶對血栓的作用時間長，與尿激酶3～5分鐘作用時間相比，納豆激酶作用長達8小時，而且安全、無副作用，因此納豆激酶活性測定的研究是所有納豆纖溶活性研究的基礎，是納豆研究和質量控制中關鍵的技術之一，對納豆生產企業具有指導意義。納豆激酶活性測定方法常見的有瓊脂糖-纖維蛋白平板法、纖維蛋白塊溶解時間法、四肽底物法、酶聯免疫吸附法和血清板法等，其中使用較多的是瓊脂糖-纖維蛋白平板法，但此法實驗操作復雜，實驗過程耗時，難以進行大批量樣品高通量篩選。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供一種納豆激酶活性測定方法。

為解決上述技術問題，本發明的技術方案是：

一種納豆激酶活性測定方法，具體步驟如下：

(1)比色管中加入硼酸緩沖液，再加入血纖維蛋白原液，振搖均勻，在37℃水浴恒溫5分鐘，其中，硼酸緩沖液與血纖維蛋白原液的體積比為7:1-3；

(2)加入凝血酶液，其中，凝血酶液與血纖維蛋白原液的體積比為1:3-5，振搖均勻，在35-40℃水浴恒溫5-15分鐘；

(3)單號管中先加入三氯乙酸溶液，終止反應，振搖均勻，在35-40℃水浴恒溫15-30分鐘；雙號管中先加入納豆樣品稀釋液，振搖均勻，在35-40℃水浴恒溫50-80分鐘，其中，所述三氯乙酸溶液、納豆樣品稀釋液與血纖維蛋白原液的體積比為20：1：3-5；

(4)單號管中加入納豆樣品稀釋液，振搖均勻，在35-40℃水浴恒溫50-80分鐘；雙號管中加入三氯乙酸溶液，終止反應，振搖均勻，在35-40℃水浴恒溫15-30分鐘，其中，所述三氯乙酸溶液、納豆樣品稀釋液與血纖維蛋白原液的體積比為20：1：3-5；

(5)反應結束后振搖均勻，將反應液于10000-14000rpm，離心處理5-6分鐘，取上清液測定275nm處的吸光度值，經計算即得納豆激酶活性；

(6)計算公式：

NK活性(FU/g)＝(AT－AB)×D/(0.01×60×0.1)

其中，AT：實驗組(雙號管)吸光度值；

??????AB：對照組(單號管)吸光度值；

??????D：樣品稀釋倍數。

優選的，上述納豆激酶活性測定方法，所述(AT－AB)的建議值范圍為0.04-0.08。

本發明的有益效果：

上述納豆激酶活性測定方法，操作簡單，試劑的成本較低，利用納豆激酶具有纖溶活性的特性，在凝血酶與血纖維蛋白原作用后，會產生凝固狀的血纖維蛋白，此時再加入納豆激酶溶液，納豆激酶會作用于血纖維蛋白，產生降解物，該降解物在波長275nm處吸光度的大小來推測酶活力的大小，是一種簡單快速檢測納豆激酶的方法，可大批量簡單方便的測定納豆激酶的活性。

附圖說明

圖1為本發明所述納豆激酶活性測定方法與瓊脂糖-纖維蛋白平板法測定值的線性關系圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明所述技術方案作進一步的說明。

實施例1

一種納豆激酶活性測定方法，具體步驟如下：

Ⅰ溶液配制：(1)0.05M硼酸緩沖液

????????????(2)0.2M三氯乙酸溶液

????????????(3)0.5％血纖維蛋白原溶液

????????????(4)30U/mL凝血酶溶液

Ⅱ樣品稀釋：精確稱量100mg天津市百奧生物技術有限公司生產的納豆待測樣品，加入純凈水定容至10.0mL,充分震蕩溶解，并進行稀釋，使得(AT－AB)之差在0.04-0.08之間。稀釋倍數按照以下公式計算：

稀釋倍數＝K×FU

其中，K：為系數，在0.7-1.6之間；

?????FU：樣品的NK活性數值(酶活單位為FU/g時的數值)

Ⅲ具體操作：