[發明專利]基于滾環擴增技術的檢測左旋色氨酸的方法

在審

• 申請號: 201410789100.7
• 申請日: 2014-12-17
• 公開（公告）號: CN104450926A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 趙國杰;關一夫
• 申請（專利權）人: 中國醫科大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 沈陽智龍專利事務所(普通合伙) 21115
• 代理人: 宋鐵軍

技術領域

本發明涉及生物化學、分子生物學、氨基酸成分確認的檢測方法，具體涉及一種基于滾環擴增技術的檢測左旋色氨酸的方法。

背景技術

左旋色氨酸(L-Trp)是構成蛋白質的20種天然氨基酸之一，是人體的8種必需氨基酸之一。作為重要的營養物質，許多的食物(原料、半成品、產品等)、飲料和調味品中都含有色氨酸。如何方便、快捷和準確的對色氨酸進行定量分析在食品檢測中具有重要意義。

色氨酸在生物體內除了合成蛋白質外，其很多代謝產物具有重要的生物學功能及意義。人體內的色氨酸主要通過兩種途徑代謝：血清素途徑和犬尿氨酸途徑。在血清素代謝途徑即5-羥色胺途徑中，首先色氨酸羥化酶催化色氨酸生成5-羥色氨酸，然后在脫羧酶作用下5-羥色氨酸生成5-羥色胺。在犬尿氨酸途徑中，吲哚胺2,3雙加氧酶(IDO)和色氨酸2,3雙加氧酶(TDO)催化色氨酸生成N-甲酰犬尿氨酸。代謝過程中產生的5羥色胺是一種重要的神經遞質，參與神經系統的眾多生理功能的調節。犬尿喹啉酸是一種興奮性氨基酸受體的拮抗劑。色氨酸代謝途徑的異常可以引起體液中色氨酸濃度的變化。因此，對色氨酸濃度進行定量檢測具有重要的醫學診斷和治療價值。

目前，最常用的檢測色氨酸的方法有HPLC法、質譜法、層析法、紫外吸收法、熒光光譜法等。但是，這些檢測分析方法均需要大型專業分析儀器設備，不僅需要專業人員來進行操作，而且對設備維護和標準化的要求也比較高。不能制備方便的小型化試劑盒。目前，可用于試劑盒檢測色氨酸的僅有ELISA法，該方法利用色氨酸抗體與色氨酸的結合檢測色氨酸，雖然降低了大型專業儀器設備的要求，但是該檢測方法需要包被、鋪板、加樣、加抗體、顯色以及每一步之間的多次洗滌步驟，操作繁瑣，易于出現人為誤差。因此，開發新的檢測方法，實現簡便、快捷、特異性高、性價比高的色氨酸檢測具有重要的意義。

發明內容

本發明針對上述現有技術存在的問題而提出一種基于滾環擴增技術的全新的檢測左旋色氨酸的方法，該方法原理是利用色氨酸操縱子的阻遏蛋白以及滾環擴增，通過該方法可以實現左旋色氨酸的簡便、快捷、可定量的檢測。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種基于滾環擴增技術的檢測左旋色氨酸的方法，其特征在于包括下述步驟：待檢測的左旋色氨酸與色氨酸阻遏蛋白結合，結合了左旋色氨酸的色氨酸阻遏蛋白通過識別由環形單鏈模板DNA與線性單鏈引物DNA形成的雙鏈上的特異性識別序列，進而抑制DNA聚合酶對線性單鏈引物DNA的延伸和擴增，滾環擴增反應的抑制程度與左旋色氨酸的濃度成正比，通過制備左旋色氨酸濃度與滾環擴增抑制率的標準曲線，檢測待測樣品對滾環擴增的抑制率，確定出待測樣品中的左旋色氨酸含量。

所述的待檢測的左旋色氨酸可以是配制的L-Trp溶液，或是各種提取或制備的生物樣本。

所述的色氨酸阻遏蛋白是細菌中調控色氨酸操縱子表達的阻遏蛋白(trpR)，該蛋白能夠特異性地結合L-Trp，并發生構象變化，提高了結合色氨酸操縱子識別序列的親和力。

所述的環形單鏈模板DNA，是作為擴增模板用于滾環擴增的單鏈DNA，并含有trpR的識別序列。

所述的線性單鏈引物DNA，是作為擴增引物用于滾環擴增的線性單鏈DNA，并含有trpR的識別序列，該線性單鏈引物DNA序列與環形單鏈模板DNA的序列堿基具有序列互補性。

所述的DNA聚合酶是用于滾環擴增的DNA聚合酶，包括但不限于phi29DNA聚合酶。

與傳統的HPLC、質譜、ELISA方法相比，本發明具有如下優點：

1、操作簡單、步驟簡便；

2、不需專業的大型儀器設備。

附圖說明

圖1是本發明的流程圖。

圖2是本發明檢測L-Trp的原理示意圖。

圖中，1、含有trpR識別序列的單鏈模板DNA：“ON-CT”；2、含有trpR識別序列的單鏈引物DNA：“ON-P”；3、DNA聚合酶；4、未結合L-Trp的trpR蛋白；5、結合L-Trp的trpR蛋白；6、L-Trp。

圖3是本發明定量測定不同濃度L-Trp的實驗結果。(A)L-Trp不同濃度時的RCA反應的熒光時間曲線；(B)L-Trp濃度和IRR的線性關系。Fluorescence?intensity(FI)：熒光強度；Time：時間；Inhibited?RCA?rate(IRR)：RCA速率抑制率；L-Trp?Concentration(μM)：左旋色氨酸濃度(微摩爾每升)。