[發明專利]一種從大豆乳清中分離純化大豆凝集素的方法

有效

• 申請號: 201410786151.4
• 申請日: 2014-12-18
• 公開（公告）號: CN104530207B
• 公開（公告）日: 2018-01-09
• 發明（設計）人: 華欲飛;李興飛;孔祥珍;張彩猛;陳業明
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C07K14/42
• 分類號: C07K14/42;C07K1/34
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙)32104
• 代理人: 時旭丹,劉品超

技術領域

本發明涉及一種從大豆乳清中分離純化大豆凝集素的方法，具體是指一種利用聚陰離子多糖回收大豆乳清中的大豆凝集素的新方法，屬于農產品加工及副產品綜合利用領域。

背景技術

大豆乳清蛋白是殘存于大豆乳清中不能為酸所沉淀的蛋白質，在大豆乳清蛋白中2S組分所占的比重較大；乳清蛋白質中除含有球蛋白、白蛋白之外，還主要含有：①Kunitz胰蛋白酶抑制劑(KTI，pH3.0~10.0，20kDa)；②Bowman-Brik胰蛋白酶抑制劑(BBI，pH3.0~10.0，20KDa)；③β-淀粉酶(61.7KDa)；④凝集素（pH 2.2~10.8，120KDa）；⑤脂氧合酶（LOX，102KDa）等多種生理活性物質，約占大豆蛋白的9%-15.3%。

大豆凝集素做為大豆中的主要抗營養因子之一，在成熟種子中的含量高達蛋白質總量的 10%左右，1909年由Wienhaus首次發現，1952年由Liener和Pallansh等分離得到，1958年制備得到純品。經過長期的研究人們發現大豆凝集素是大豆中能夠特異性結合半乳糖、半乳糖胺、N-乙?；?D-半乳糖胺的四聚體糖蛋白。雖然它的生物學活性可通過適當方法去除，但仍會有一定量的殘留。大豆凝集素可以抵抗體外和胃腸道內蛋白酶的降解，因此，被動物采食后可結合到胃腸道上皮細胞表面，影響胃腸道黏膜的分泌、吸收、增生等，這是大豆凝集素引發抗營養作用的前提和必要條件。然而，現有研究表明大豆凝集素在適宜的濃度下可以表現出多種功能特性。例如，凝集素對于大鼠腸是很有效的外源生長因子，可誘導完全可逆的多胺依賴性小腸增生；低劑量的凝集素可減少身體的脂肪含量，可用于治療肥胖和非醫療性的減肥；此外，凝集素還能夠促進 F-actin 向 G-actin 的轉變，影響細胞形態。

由于大豆凝集素具有上述的特性，大豆凝集素的應用范圍十分廣泛，動物營養學用純品凝集素研究其對動物的抗營養作用；大豆凝集素作為識別含有半乳糖，半乳糖胺，N-乙酰氨基-D-半乳糖糖鏈的探針，用于細胞表面的糖基化模式的研究；以及對于標記癌癥的分化程度有重要作用等多個領域。目前市場對純化的大豆凝集素需求日益增加，大多依賴進口，價格也比較昂貴。大豆凝集素傳統的純化方法包括離子交換和磷酸鈣層析。Liener 和 Pallansch(1952) 采用等電點沉淀、硫酸銨分級沉淀法分離得到了純化的大豆凝集素。Wade 等 (1958)、張洪淵等 (1991) 采用離子交換纖維素、羥基磷灰石 (HA) 柱層析等方法成功進行了大豆凝集素的分離純化。親和層析也被應用于大豆凝集素的純化過程，并且純化工藝在不斷更新。由于傳統的大豆凝集素純化方法的純化效率較低，因而人們利用大豆凝集素能與N-乙?；?D-半乳糖胺、半乳糖等配基或配體發生特異性結合的能力制備了大豆凝集素親和純化體系。根據所采用親和介質的不同，主要分為半乳糖胺-CH-Sepharose 4B、N-乙酰基-D-半乳糖胺-Sepharose 6B和瓜爾膠親和層析體系。例如CN102212112A公開了利用親和層析填料 D-GalN-FF-sepharose 4B純化得到大豆凝集素的方法。以上體系均存在一定的限制，瓜爾膠純化效率和純度較低，N-乙?；?D-半乳糖胺-Sepharose 6B 由于配基 N-乙?；?D-半乳糖胺成本較高限制了其大規模使用，半乳糖胺-CH-Sepharose4B 流速有一定限制，以上的分離純化流程都具有比較繁瑣復雜的程序，條件控制相對嚴格。本發明采用了天然可食性的聚陰離子多糖作為回收材料，充分利用蛋白與多糖的復凝聚原理，操作簡單，其形成的復凝聚物既可以作為食品材料直接利用，也可以完整實現蛋白與多糖的分離。從資源回收利用的角度來看，本發明不僅可以有效降低大豆乳清的抗營養組分，還可以制備具有高純度的大豆凝集素組分。

發明內容

本發明的目的是提供一種從大豆乳清中分離純化大豆凝集素的方法，該發明制備的大豆凝集素純度約90%-93%，仍然保持天然的生理活性。

本發明的技術方案，一種從大豆乳清中分離純化大豆凝集素的方法，步驟如下：

（1）大豆乳清的預處理：將大豆乳清調至pH 4.5-4.8，9500rpm離心30min，除沉淀；再次調至pH 8.0-10.0，9500rpm離心30min，收集上清液，即得大豆乳清液；

用pH調節劑調節pH；