[發明專利]一種酶法降解幾丁質生產N?乙酰氨基葡萄糖的方法

有效

• 申請號: 201410785604.1
• 申請日: 2014-12-18
• 公開（公告）號: CN104388496B
• 公開（公告）日: 2017-12-22
• 發明（設計）人: 陳可泉;張阿磊;高聰;何珣;歐陽平凱
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12P19/26
• 分類號: C12P19/26;C12N9/42;C12R1/01
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司32200
• 代理人: 李紀昌,曹翠珍

技術領域

本發明涉及一種酶法降解幾丁質生產N-乙酰氨基葡萄糖的方法。

背景技術

甲殼素(C₈H₁₃O₅N)n ，又名幾丁質、甲殼質或殼多糖，由N-乙酰氨基葡萄糖通過糖苷鍵結合起來的聚合物，是一種含氮多糖類物質，為蝦、蟹、昆蟲等甲殼的重要成分。分子結構為長鏈狀，由8000個單體組成的多糖，為自然界的一種半透明而堅固的材料。幾丁質能通過化學法和生物酶法被降解成幾丁寡糖及單糖，目前常用的化學降解法具有環境污染巨大、反應效率低、產品質量差、過程不易控制等缺點，已逐步被生物酶法降解幾丁質取代。

N-乙酰氨基葡萄糖是殼多糖保健食品系列中最新的第三代保健機能性食品添加劑，可作低熱量的甜味劑，也可作為抗癌、防癌、降血脂、降血壓的食品添加劑。主要用于臨床增強人體免疫系統的功能，抑制癌細胞或纖維細胞的過度生長，對癌癥和惡性腫癌能起到抑制和治療作用，此外，N-乙酰氨基葡萄糖對于骨關節炎及關節疼痛也有治療作用。

目前報道的微生物發酵所產幾丁質酶酶活普遍較低，在降解幾丁質生產 N-乙酰氨基葡萄糖時轉化效率低，難以滿足工業化生產需求。因此對酶液進行濃縮，提高降解效率是很有必要的。傳統酶濃縮方法包括鹽沉，反滲透等方法，存在諸多問題：鹽沉過程酶活損失大，操作繁瑣；凝膠吸附法成本高昂，難以推廣。此外，幾丁質降解產物既可以作為菌體利用的碳源又可作為氮源，轉化過程難以控制，極易染菌。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明的目的在于提供了一種酶法降解幾丁質生產N-乙酰氨基葡萄糖的方法，通過調控優化微生物產酶、對酶液進行濃縮，轉化過程中采取抑菌措施，進而能高效、安全的降解幾丁質生產幾丁寡糖產品。

為解決現有技術問題，本發明采用的技術方案為：

一種酶法降解幾丁質生產N-乙酰氨基葡萄糖的方法，包括以下步驟：

步驟1，微生物發酵產幾丁質酶

選產幾丁質酶的菌株作為種子，在37℃、200 rpm下培養得種子液，再以體積分數5%~10%接種量接入裝有產酶發酵培養基的發酵罐，裝液量40-60%，培養溫度24℃~37℃，轉速為200~500 rpm，通氣量1vvm~3vvm，初始pH7.0~8.0，發酵72~96h后收集發酵液；

步驟2，粗酶液的獲得

將步驟1獲得的發酵液低溫高速離心，分離菌體，收集上清液，得到幾丁質酶粗酶液，低溫貯存，備用；

步驟3，濃縮酶液

將步驟2中所得得到的幾丁質粗酶液，低溫透析濃縮得到濃縮酶液，測粗酶液和濃縮酶液酶活，計算回收率；

步驟4，生產N-乙酰氨基葡萄糖

利用步驟3中獲得的濃縮酶液無菌轉化幾丁質，其中，轉化體系的溫度為25-37℃，攪拌速度為200 rpm，轉化24-72 h，液相法檢測N-乙酰氨基葡萄糖濃度。

作為優選的是，所述產幾丁質酶的菌株為Chitinolyticbacter meiyuanensisSYBC-H1 (CGMCC NO：3438；ATCC BAA-2140)或Chitinibactersp.GC72（CCTCC NO ：M2014113）。

作為優選的是，步驟3，濃縮用變色硅膠或無色硅膠與變色硅膠的混合物。

作為優選的是，步驟3，濃縮溫度為4℃，濃縮時間2-12h。

作為優選的是，步驟4，還包括占轉化體系體積分數為0.1-0.2%的抗生素，所述所述抗生素為卡納或四環素。

測酶活所用方法為DNS法：將1.9 mL 0.05mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）和0.5 mL 1%的膠體幾丁質加100μl酶液組成的反應體系，37℃水浴30 min，沸水浴5 min中止反應，加入2 mL DNS試劑，沸水浴5 min，冷卻至室溫，離心后取上清液，在波長535 nm下測吸光度，以滅活的等量酶液作空白對照。

有益效果

（1）利用硅膠及透析袋濃縮幾丁質酶液，較傳統濃縮酶液的方法具有操作簡單，成本低，高酶活回收率的優勢。硅膠吸水快，能很直觀看到吸水情況，節約生產時間，不需要外界能量輔助，且能重復利用。

（2）采用高濃度酶液生產N-乙酰氨基葡萄糖效率高，快速，大大降低了生產成本。

（3）采用往轉化體系中加入適量抗生素，可有效地防止染菌，降低了安全隱患。

（4）轉化體系是經過實驗優化，轉化效率高。

具體實施方式