[發(fā)明專利]一步式真核細胞多基因修飾載體構建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410785444.0
• 申請日: 2014-12-16
• 公開（公告）號: CN104531749B
• 公開（公告）日: 2018-10-26
• 發(fā)明（設計）人: 彭魯英;劉暢;李麗;康志騫;王鐸
• 申請（專利權）人: 同濟大學
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12N15/66
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 葉敏華

本發(fā)明涉及一步式真核細胞多基因修飾載體構建方法，首先應確定欲修飾的基因數(shù)目N，然后將各個基因的CDS區(qū)分別引入pOE?1至pOE?N中，同時也可以將每個基因對應的shRNA序列分別引入pSH?1至pSH?N中。通過將pOE?1至pOE?N和pDV?N加入同一個反應體系中，即可一步式構建出N個基因串聯(lián)過表達的最終質粒；或者將pSH?1至pSH?N和pDV?N加入同一個反應體系中，即可一步式構建出N個基因同時knock?down的最終質粒；同樣的，也可以選擇其中幾個基因的過表達質粒和另外基因的knock?down質粒和pDV?N加入同一個反應體系中，即可一步式構建出既含有多個基因過表達，同時將另一些基因knock?down的最終載體。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的構建過程一步式，過程簡便，效率高，同時可對多個目的基因進行任意組合。

技術領域

本發(fā)明涉及一種一步式真核細胞多基因修飾載體構建方法，屬于真核細胞水平基因功能分析技術領域。

背景技術

真核細胞多基因修飾載體構建一般需要多步驟進行，方法繁瑣。

目前商業(yè)化的相似產品主要包括Clontech公司的In-fusion試劑盒與NEB公司的Gibson組裝試劑盒，兩種產品僅提供連接反應體系，用戶需要自己準備載體體系而且兩個公司的反應體系存在下列限制：

1)需要進行長片段的PCR擴增，從而使得最終構建的多基因表達載體容易產生突變；

2)兩種方法均需要額外合成多條引物，并且增加了PCR擴增、產物膠回收等步驟，既增加了額外費用，又較繁瑣；

3)兩種方法構建的載體需要特異的感受態(tài)細胞進行轉化，不適用實驗室普通感受態(tài)細胞，需要額外進行購置。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術存在的缺陷而提供一種廣泛應用于真核細胞水平基因功能分析實驗的一步式真核細胞多基因修飾載體構建方法。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術方案來實現(xiàn)：

一步式真核細胞多基因修飾載體構建方法，包括以下步驟：

1)構建過表達質粒：

1.1)確定欲過表達的基因個數(shù)為N，所述的N為大于1的正整數(shù)，下同；；

1.2)將欲過表達的N個基因的CDS區(qū)按順序分別插入到N個質粒pOE-1、pOE-2直到pOE-N中，并轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，過夜培養(yǎng)；

1.3)使用定點突變的方法將基因CDS中的BsaI位點進行突變，同時保證其所編碼的氨基酸不變；

1.4)使用菌落PCR篩選出陽性克隆子并擴增；

1.5)分別提取N個質粒，并將質粒濃度調整到200ng/μl；

2)構建敲低質粒：

2.1)確定欲敲低的基因個數(shù)為N；

2.2)將欲敲低的N個基因的shRNA oligo按順序分別引入到N個質粒pSH-1、pSH-2直到pSH-N中，并轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，過夜培養(yǎng)；

2.3)挑選3個克隆子，并測序驗證，并將質粒濃度調整到200ng/μl；

3)構建過表達和敲低混合質粒：

3.1)將欲過表達的基因的CDS或欲敲低的基因的shRNA oligo分別引入pOE質粒和pSH質粒中，例如，欲過表達第1、3和5號基因，而欲敲低第2、4和6號基因，則將第1、3和5號基因的CDS區(qū)域分別引入pOE-1、pOE-3和pOE-5中，而將第2、4和6號基因的shRNA oligo引入到pSH-2，pSH-4和pSH-6中；