[發明專利]一步式真核細胞多基因修飾載體構建方法

有效

• 申請號: 201410785444.0
• 申請日: 2014-12-16
• 公開（公告）號: CN104531749B
• 公開（公告）日: 2018-10-26
• 發明（設計）人: 彭魯英;劉暢;李麗;康志騫;王鐸
• 申請（專利權）人: 同濟大學
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12N15/66
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 葉敏華

1.一步式真核細胞多基因修飾載體構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)構建過表達質粒：

1.1)確定欲過表達的基因個數為N；

1.2)將欲過表達的N個基因的CDS區按順序分別插入到N個質粒pOE-1、pOE-2直到pOE-N中，并轉化大腸桿菌感受態細胞，過夜培養；

1.3)使用定點突變的方法將基因CDS中的BsaI位點進行突變，同時保證其所編碼的氨基酸不變；

1.4)使用菌落PCR篩選出陽性克隆子并擴增；

1.5)分別提取N個質粒；

2)構建敲低質粒：

2.1)確定欲敲低的基因個數為N；

2.2)將欲敲低的N個基因的shRNA oligo按順序分別引入到N個質粒pSH-1、pSH-2直到pSH-N中，并轉化大腸桿菌感受態細胞，過夜培養；

2.3)挑選3個克隆子，并測序驗證；

3)構建過表達和敲低混合質粒：

3.1)將欲過表達的基因的CDS或欲敲低的基因的shRNA oligo分別引入pOE質粒和pSH質粒中；

3.2)通過測序和菌落PCR驗證序列的正確性，并將BsaI位點進行突變；

4)按體積比，在離心管中順序加入如下樣品：

5)將步驟4)混合體系混勻后置于PCR儀中，進行加熱反應；

6)反應結束后，取出反應物，并加入ATP和PlasmidSafe DNase，其中，反應產物、ATP與PlasmidSafe DNase體積比為16:2:2；

7)步驟6)所得體系在37℃條件下孵育，然后將反應產物轉化入感受態細胞中，并涂布于含有IPTG和X-gal的kana平板上，37℃孵育過夜；

8)第二天，挑取3個藍色菌落進行擴增；

9)第三天，提取質粒并鑒定；

所述的N為大于1的正整數，

pOE質粒均包含有一個CMV啟動子、一個多克隆位點、一個bGH polyA序列、一個ori復制區和一個四環素抗性基因，并且兩個BsaI位點分別位于CMV啟動子上游和bGH polyA序列下游；pOE-1～pOE-10質粒區別僅僅是BsaI切割位點序列不同，其余結構部分完全相同，其中質粒pOE-1～pOE-10用于基因的過表達；

pSH質粒均包含有一個U6啟動子、一個多克隆位點、一個ori復制區和一個四環素抗性基因，兩個BsaI位點分別位于U6啟動子上游和下游；pSH-1～pSH-10質粒區別僅僅是BsaI切割位點序列不同，其余結構部分完全相同，pSH-1～pSH-10用于基因的敲低；

pBL質粒均包含有一段100bp的非編碼stuffer序列、一個多克隆位點、一個ori復制區和一個四環素抗性基因，兩個BsaI位點分別位于非編碼stuffer序列的上游和下游；pBL-1～pBL-10質粒區別僅僅是BsaI切割位點序列不同，其余結構部分完全相同，pBL-1～pBL-10用于填補位置空缺；

pDV質粒均包含有一個CMV啟動子、一個EGFP編碼序列、一個SV40polyA序列、一個SV40啟動子、一個NeoR/KanaR序列、一個ori復制區和一個lacZ基因，兩個BsaI位點分別位于lacZ基因的上游和下游；pDV-1～pDV-10質粒區別僅僅是BsaI切割位點序列不同，其余結構部分完全相同，pDV-1～pDV-10為最終目的載體。

2.根據權利要求1所述的一步式真核細胞多基因修飾載體構建方法，其特征在于，所述的過表達質粒、敲低質粒或過表達和敲低混合質粒提取后，將質粒濃度調整到200ng/μl。

3.根據權利要求1所述的一步式真核細胞多基因修飾載體構建方法，其特征在于，所述的pDV-N質粒濃度為25ng/μl，所述的ATP濃度為10mM。

4.根據權利要求1所述的一步式真核細胞多基因修飾載體構建方法，其特征在于，步驟5)中，進行加熱反應的程序為：

37℃加熱5min，然后20℃加熱5min，進行20個循環后，再繼續37℃加熱5min，之后升溫到80℃加熱20min。