[發(fā)明專利]一種改進的細胞化學融合方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201410783452.1 | 申請日： | 2014-12-16 |
| 公開（公告）號： | CN105754986A | 公開（公告）日： | 2016-07-13 |
| 發(fā)明（設計）人： | 周濤;孫衛(wèi)兵;張躍建 | 申請（專利權(quán)）人： | 上海復星長征醫(yī)學科學有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/06 | 分類號： | C12N15/06 |
| 代理公司： | 上海新天專利代理有限公司 31213 | 代理人： | 王巍 |
| 地址： | 200444 *** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 改進 細胞 化學 融合 方法 | ||
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體涉及一種改進的細胞化學融合方法。
背景技術(shù)
1975年，德國科學家Kohler和英國科學家Milstein將骨髓瘤細胞與免疫的動物脾細胞融合，形成的雜交細胞即可產(chǎn)生抗體，又可無限增殖，從而創(chuàng)立了具有劃時代意義的PEG(聚乙二醇polyethyleneglycol)化學融合法雜交瘤技術(shù)。聚乙二醇分子可在質(zhì)膜之間形成分子橋，使細胞質(zhì)膜發(fā)生粘連促使質(zhì)膜的融合(王克明.細胞融合技術(shù)及其發(fā)展[J].浙江科技學院學報，2004，16(2)：113—116)，即傳統(tǒng)的“一步法”(過程如說明書附圖1所述)。目前，PEG化學融合法由于其融合成本低，無需特殊設備，簡便、融合效率高，因此在1975年獲得成功后很快取代了仙臺病毒法。但是PEG對細胞有毒害作用，雖然，隨著PEG分子量的增加，其融合效率提高，但是其對細胞的毒害作用也隨之增加，如要應用，亟待改進細胞化學融合方法。但是考慮到融合前的細胞對PEG的毒性抵抗力較強，而后期剛剛形成的雜交瘤細胞對PEG的毒性抵抗力較弱，因此可采用前期使用高分子量的PEG以促使細胞相互粘連，后期改用低分子量PEG促使細胞之間繼續(xù)完成融合，這樣能有效提高細胞的融合率。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服上述不足之處，研究設計一種簡便、高效的細胞化學融合方法。
本發(fā)明基于考慮到融合前的細胞對PEG的毒性抵抗力較強，而后期剛剛形成的雜交瘤細胞對PEG的毒性抵抗力較弱，因此，前期使用高分子量的PEG以促使細胞相互粘連，后期改用低分子量PEG促使細胞之間繼續(xù)完成融合，這樣就能有效提高細胞的融合率。
本發(fā)明提供了一種改進的細胞化學融合方法，包括以下步驟：
(1)將A細胞與B細胞兩株細胞混合置于細胞融合管，向融合管內(nèi)的細胞團滴加0.5ml50％PEG3000～4000溶液，20秒內(nèi)完成，邊加邊晃動細胞團，以使細胞團充分接觸融合劑PEG溶液；
(2)接著滴加0.5ml50％PEG1500～2500溶液，40秒內(nèi)完成，邊加邊晃動融合管，以使細胞團充分接觸融合劑PEG溶液；
(3)細胞團于融合管內(nèi)靜置30s至1min終止融合。
本發(fā)明的細胞化學融合方法，所述細胞選自A與B兩株細胞之間任意組合的融合。所述A細胞和B細胞以2:1-10:1的比列組合。
所述A細胞選自Balb/C小鼠B淋巴細胞或昆明小鼠T淋巴細胞；B細胞選自SP2/0骨髓瘤細胞、NS-1骨髓瘤細胞或X63Ag8.653骨髓瘤細胞。
本發(fā)明的細胞化學融合方法，所述步驟(1)PEG3000～4000溶液的pH8.0～8.2，含5％DMSO。所述步驟(2)PEG1500～2500溶液的pH8.0～8.2，含10％DMSO。
本發(fā)明的細胞化學融合方法，所述步驟(3)向融合管內(nèi)加入20～30ml無血清DMEM培養(yǎng)基(dulbecco'smodifiedeaglemedium)或RPMI1640培養(yǎng)基(RoswellParkMemorialInstitute)溶液來稀釋PEG以達到終止細胞融合作用。
本發(fā)明的細胞化學融合方法，整個融合過程均在37℃水浴中進行。
本發(fā)明的細胞化學融合方法適用于本發(fā)明涉及的技術(shù)領(lǐng)域，同種屬的或者具有相近親緣關(guān)系的兩株細胞。
本發(fā)明的細胞化學融合方法選自A細胞與B細胞兩株細胞之間任意組合的融合。所述A細胞和B細胞以2:1至10:1的任意比列組合。
本發(fā)明所述細胞化學融合方法的A細胞選自Balb/C小鼠B淋巴細胞或昆明小鼠T淋巴細胞；B細胞選自SP2/0骨髓瘤細胞、NS-1骨髓瘤細胞、SP2/0骨髓瘤細胞、X63Ag8.653骨髓瘤細胞。
本發(fā)明的效果：
本發(fā)明與傳統(tǒng)的“一步法”細胞融合方法相比較，能夠顯著地提高細胞融合率和陽性率。本發(fā)明的細胞融合方法融合率能達到60％以上(傳統(tǒng)的“一步法”細胞融合率＜50％(李紋.細胞融合實驗方法的改進[J].汕頭大學醫(yī)學院學報，2005，18(3)：183—184)，陽性率大于30％(傳統(tǒng)的“一步法”細胞融合陽性率＜30％(趙詠梅，郭云婷，馬蕊，郭碧瑩，邵莎莎.PEG介導細胞融合的最適條件探究[J].西安文理學院學報：自然科學版,2007,10(3))。
本發(fā)明所述的細胞融合方法，可用于制備單克隆抗體或者細胞因子等生物大分子，有較大的應用價值。
附圖說明
圖1PEG介導A、B兩細胞融合過程。
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