[發明專利]一種金柑三倍體的育種方法

有效

• 申請號: 201410779338.1
• 申請日: 2015-08-03
• 公開（公告）號: CN104488696A
• 公開（公告）日: 2015-07-29
• 發明（設計）人: 黃桂香;張樹偉
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: A01H1/02
• 分類號: A01H1/02;A01H1/08
• 代理公司: 北京中譽威圣知識產權代理有限公司 11279
• 代理人: 王正茂

技術領域

本發明屬于果樹遺傳育種技術領域，具體來說是涉及一種金柑三倍體的育種方法。

背景技術

金柑為蕓香科(Rutaceae)柑橘亞科(Aurantioideae)金柑屬(Fortunella?Swingle)植物，金柑屬共有6個種和1個變種。金柑為栽培種類的統稱，一年可多次開花結果，果實色艷形美，營養豐富，有吉祥喜慶之寓意，是鮮食、加工和觀賞的多用型果樹。金柑屬所有種均原產我國，然而目前栽培的金柑品種較少，鮮食類型只有金彈一種。陽朔金柑是目前栽培面積較大，經濟效益較好的鮮食代表品種。

多倍體育種是果樹育種的重要方法，多倍體果樹具有植株生長旺盛、果大、無籽或少籽，產量高、同化物質含量高、適應性強和抗逆性強等特點，目前較有應用價值的多倍體是四倍體和三倍體，特別是三倍體果樹，大多數高度不育，果實無核或少核，對提高果實可食率和加工品質具有重要的作用。

金柑的鮮食栽培品種均為多胚性，多胚性是有效獲得雜種和三倍體品種的最大障礙，因此，傳統的通過四倍體和二倍體雜交獲得三倍體的途徑在多胚性的金柑類品種中因珠心胚的干擾和種胚敗育等因素的影響而難以實現。

本發明是利用多胚性品種先進行四倍體誘導，在四倍體種子中進行種胚分離培養，從而獲得三倍體的方法。該方法較傳統的胚乳培養、四倍體與二倍體有性雜交等方法簡便易行，獲得三倍體比例較高，避開了有性雜交、珠心胚干擾和種胚敗育等障礙，可有效獲得三倍體，縮短三倍體育種年限。該方法適用于多胚性金柑等柑橘類果樹三倍體的獲得。

現有技術中獲得三倍體的途徑，通常是采用四倍體和二倍體的有性雜交和胚乳培育等，其中，對于多胚性的果樹由于珠心胚的干擾，難于獲得三倍體，而胚乳培育獲得三倍體的途徑由于技術要求比較高、再生植株生長不良等因素，目前還沒有成功獲得三倍體栽培品種的報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種金柑三倍體的育種方法。本發明提供的技術方案是：

一種金柑三倍體的育種方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)四倍體誘導：選擇金柑成熟果實的飽滿種子，去除外種皮，浸泡4-6h后將內種皮剝除，使種胚分離，然后將其置于0.1-0.2％濃度的秋水仙素溶液中浸泡24-48h；

(2)誘變種子的催芽培育：取出浸泡的種子，清洗后先在光照培養箱中催芽發根，保濕，待發根后，剪取1-2cm根尖置于卡諾氏固定液固定液(95％乙醇：冰醋酸＝3:1)中固定，依次編號，用做染色體倍性檢測；

(3)染色體倍性檢查；

(4)四倍體植株的培育：將步驟(3)中檢查結果為四倍體的種胚編號選出，繼續在沙盆中培養，待幼苗長出真葉，移栽到營養杯中，于溫室內培養至第一次梢成熟后進行移栽；

(5)四倍體果實采收和取種：對移栽后的四倍體植株按照金柑類果樹的常規田間管理技術管理2-3年，待果實成熟即可采收，取種；

(6)四倍體種胚分離培養；

(7)種胚染色體檢測：待種胚生根，進行染色體倍性檢查，檢查方法同步驟(3)；

(8)三倍體苗的培育：將步驟(7)中檢查為三倍體的種胚進行培育，培育的方法同步驟(4)。

作為優選，步驟(2)中卡諾氏固定液為按體積比95％乙醇：冰醋酸＝3：1配制而成。

其中，步驟(3)所述染色體倍性檢測包括以下步驟：

①預處理：將培養好的根尖剪下1-2cm，用0.002mol/L?8-羥基喹啉進行預處理2小時，用0.075mol/L?KCL溶液進行前低滲20min，用1mol/L的鹽酸在60℃水浴鍋中解離7min，再轉入0.075mol/L?KCL中后低滲15min，在蒸餾水中浸泡10min；

②改良卡寶品紅液的配制：取原液C?10-20mL，加45％乙酸溶液80-90mL、山梨醇1.8g，即配成10-20％改良卡寶品紅液；

③染色體制片：將解離好的根尖用蒸餾水沖洗后放到載玻片上，切取約2mm的根尖分生組織，加1滴改良卡寶品紅液染色6-10min，然后在顯微鏡下觀察；

④染色體數目的確定：選擇20-40個完整、染色體分散好和清晰的細胞進行染色體計數，確定染色體數目。

其中，步驟②中所述原液C是取原液B?45mL，加冰乙酸和福爾馬林各6mL所得；所述原液B是取原液A?10mL，加入90mL的5％石炭酸水溶液所得；所述原液A是取3g堿性品紅溶于100mL的70％乙醇中所得。

其中，步驟(6)所述四倍體種胚分離培養包括以下步驟：