[發明專利]一種提高AA-2G轉化率的環糊精葡萄糖基轉移酶突變體

在審

• 申請號: 201410779194.X
• 申請日: 2014-12-16
• 公開（公告）號: CN104531629A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發明（設計）人: 吳敬;宿玲恰;陳晟;熊艷軍
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/63;C12P19/60;C12R1/07
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 張勇

技術領域

本發明涉及一種提高AA-2G轉化率的環糊精葡萄糖基轉移酶突變體，屬于基因工程和酶工程領域。

背景技術

維生素C(VC)是一種人體自身不能合成的水溶性維生素，參與體內很多的生理活動，如促進膽固醇轉變為膽汁酸，促進腎上腺皮質激素的合成，參與芳香氨基酸的代謝，促進鐵的吸收及參與體內多種氧化還原反應，在維持和促進人體健康中扮演著重要的角色。另外，維生素C還能促進膠原蛋白的合成，還原已形成的黑素，對保持皮膚彈性、美白、除皺有一定的作用。廣泛應用于食品、醫藥、化妝品等領域。但是VC二位碳的羥基極不穩定，非常容易氧化降解而限制了其應用。2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸(AA-2G)是一種維生素C的糖類衍生物，是最穩定、性能最佳的VC替代品，近些年主要作為一種美白添加劑應用于多種品牌的高端化妝品中。

目前，全世界應用于化妝品中的AA-2G均由日本林原公司一家提供，其在市場上占有壟斷的地位。AA-2G的價格約為3000元/kg，大概是維生素C的100多倍，可見其市場價值。我國是維生素C生產大國，國內VC生產企業擁有超過全球80％產能，然而我國VC產品四分之三用于出口，內銷部分主要用于醫藥，品種較單調。我國對AA-2G的研究也有報道，但僅屬于初步的探索階段，尚未達到工業化水平。因此挖掘優化適合生產AA-2G的糖基轉移酶對于推動我國AA-2G的工業化具有十分重要的意義。

本發明所使用的來源于Bacillus?stearothermophilus?NO2環糊精葡萄糖基轉移酶CGTase雖然在轉化過程中能夠實現AA-2G的生產，但其后提取工藝仍不可缺少。如何提高底物轉化率，節約成本，簡化后提取工藝將成為環糊精葡萄糖基轉移酶的研究方向。

發明內容

本發明所要解決的一個技術問題是提供一種環糊精葡萄糖基轉移酶的突變體，包括含有一個或兩個相對于Bacillus?stearothermophilus?NO2環糊精葡萄糖基轉移酶活性氨基酸殘基的取代，與親本相比有更高的AA-2G轉化效率。

所述環糊精葡萄糖基轉移酶的親本基因與NCBI數據庫中的Bacillus?stearothermophilus?NO2環糊精葡萄糖基轉移酶一致(登錄號X59042.1)。

所述環糊精葡萄糖基轉移酶的親本基因編碼的成熟蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所述。

所述突變體相對于氨基酸序列為SEQ?ID?NO.1所示的環糊精葡萄糖基轉移酶發生了一個或兩個氨基酸位點的突變。

所述突變與CGTase產AA-2G的轉化率相關。

所述發生突變的氨基酸位點是第228位的賴氨酸或第367位的天冬氨酸。

所述突變體是將SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列中第228位的賴氨酸(Lys)突變為精氨酸(Arg)，命名為K228R，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

所述突變體是將SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列中第367位的天冬氨酸(Asp)突變成絲氨酸(Ser)，命名為D367S所示。

所述突變體是將SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列的第228位的賴氨酸(Lys)突變為精氨酸(Arg)，同時將第367位的天冬氨酸(Asp)突變成絲氨酸(Ser)，得到的突變體命名為K228R/D367S。

本發明所要解決的另一個技術問題是提供一種環糊精葡萄糖基轉移酶的突變體的制備方法，包括如下步驟：

(1)在Bacillus?stearothermophilus?NO2環糊精葡萄糖基轉移酶氨基酸序列的基礎上確定突變位點；設計定點突變的突變引物，以攜帶環糊精葡萄糖基轉移酶基因的載體為模板進行定點突變；構建含突變體的質粒載體；

(2)將突變體質粒轉化進宿主細胞；

(3)挑選陽性克隆進行發酵培養，并純化環糊精葡萄糖基轉移酶突變體K228R、D367S、D367S/K228R。

所述質粒載體為pUC系列，pET系列，或pGEX中的任意一種。

所述宿主細胞為細菌和真菌細胞，其也為本發明的保護范圍。

所述的細菌為革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽性菌。