[發(fā)明專利]一種他達(dá)那非及其類似物的納米膠體金標(biāo)記免疫測定方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410777149.0
• 申請日: 2014-12-17
• 公開（公告）號: CN104502554B
• 公開（公告）日: 2017-11-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 郭杰標(biāo);張敏瀅
• 申請（專利權(quán)）人: 韶關(guān)學(xué)院
• 主分類號: G01N33/02
• 分類號: G01N33/02;G01N33/15;G01N33/68
• 代理公司: 廣州駿思知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司44425
• 代理人: 潘雯瑛

1.一種他達(dá)那非及其類似物的納米膠體金標(biāo)記免疫測定方法，其特征在于：

所述方法的具體步驟如下：

(1)對他達(dá)那非進(jìn)行肟化衍生化方法，并把肟化他達(dá)那非分別連接到陽離子化牛血清白蛋白和卵清蛋白載體，構(gòu)建把他達(dá)那非及其類似物共同結(jié)構(gòu)暴露在外部的突出他達(dá)那非及其類似物共有基團(tuán)人工免疫抗原和人工檢測抗原；

所述的突出他達(dá)那非及其類似物共有基團(tuán)人工免疫抗原的合成方法如下：采用改良活性酯法合成免疫抗原，將0.5mg半抗原溶于0.5mL無水甲醇，再加入0.05g碳二亞胺和0.01g N-羥基琥珀酰亞胺，室溫下反應(yīng)過夜，離心分離沉淀物，取上清液，逐滴加入溶解在1.0mL的碳酸緩沖液的含5mg陽離子化牛血清白蛋白的溶液中，室溫震蕩反應(yīng)4小時，生理鹽水透析72小時除去未反應(yīng)的他達(dá)那非及其類似物，每6小時換透析液一次，分裝凍存于-20℃冰箱；

所述的突出他達(dá)那非及其類似物共有基團(tuán)人工檢測抗原的合成方法是將肟化他達(dá)那非用碳二亞胺法與卵清白蛋白偶聯(lián)合成；

(2)使用突出他達(dá)那非及其類似物共同結(jié)構(gòu)的人工免疫抗原免疫家兔，誘導(dǎo)產(chǎn)生抗他達(dá)那非及其類似物多克隆抗體，收集血清并使用免疫親和層析法純化得到抗他達(dá)那非及其類似物特異性抗體；

(3)膠體金的制備；

(4)將抗他達(dá)那非及其類似物特異性抗體標(biāo)記于納米膠體金；

(5)把抗他達(dá)那非及其類似物特異性抗體標(biāo)記在在硝酸纖維素膜NC膜載體的檢測線T線上，羊抗兔IgG固化在質(zhì)控線上，構(gòu)建膠體金檢測卡；

(6)檢測樣品時在樣品檢測溶液中添加檢測抗原，在檢測過程中NC膜T線上的固相抗體和膠體金上標(biāo)記的抗體分別與檢測抗原上的他達(dá)那非及其類似物共同結(jié)構(gòu)結(jié)合，在NC膜T線位置形成雙抗體夾心免疫結(jié)合物，使T線顯色產(chǎn)生檢測信號，樣品中存在目標(biāo)檢品，免疫反應(yīng)就會被競爭阻斷，T線顏色會消失。

2.如權(quán)利要求1所述的他達(dá)那非及其類似物的納米膠體金標(biāo)記免疫測定方法，其特征在于：步驟(1)中，所述的他達(dá)那非肟化衍生化方法的具體步驟如下：取2mg他達(dá)那非溶解在2mL無水吡啶溶液中，加入5mg羧甲基羥胺，室溫?fù)u晃反應(yīng)過夜，次日把吡啶用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，用5mL碳酸氫鈉溶液溶解反應(yīng)物，棄去沉淀，然后用鹽酸調(diào)節(jié)pH值到3.0，用乙酸乙酯抽提，棄去水相，將收集的乙酸乙酯用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，得到肟化他達(dá)那非。

3.如權(quán)利要求1所述的他達(dá)那非及其類似物的納米膠體金標(biāo)記免疫測定方法，其特征在于：步驟(1)中，所述的突出他達(dá)那非及其類似物共有基團(tuán)人工檢測抗原的合成方法如下：采用碳二亞胺法合成檢測抗原，將0.2mg肟化他達(dá)那非溶于0.5mL無水甲醇，加入到1.0mL含5mg陽離子化卵清白蛋白的碳酸緩沖液溶液中，再加入0.05g碳二亞胺和0.01gNHS，室溫下震蕩反應(yīng)過夜，離心分離沉淀物，取上清液，磁力攪拌反應(yīng)4小時，生理鹽水透析72小時除去未反應(yīng)的肟化他達(dá)那非活潑酯，每6小時換透析液一次，分裝凍干備用。

4.如權(quán)利要求1或3所述的他達(dá)那非及其類似物的納米膠體金標(biāo)記免疫測定方法，其特征在于：所述的碳酸緩沖液的pH＝8.5。

5.如權(quán)利要求1所述的他達(dá)那非及其類似物的納米膠體金標(biāo)記免疫測定方法，其特征在于：步驟(3)中，膠體金采用常規(guī)的檸檬酸還原法制備。

6.如權(quán)利要求1所述的他達(dá)那非及其類似物的納米膠體金標(biāo)記免疫測定方法，其特征在于：步驟(5)的具體步驟為：用微定量噴頭噴涂兩條平行線于硝酸纖維素膜上，抗他達(dá)那非及其類似物抗體作為檢測線，羊抗兔IgG作為質(zhì)控線，用定量噴頭噴涂金標(biāo)記抗他達(dá)那非及其類似物抗體于玻璃纖維素膜上，干燥硝酸纖維素膜和玻璃纖維素膜后備用。

7.如權(quán)利要求1所述的他達(dá)那非及其類似物的納米膠體金標(biāo)記免疫測定方法，其特征在于：步驟(6)的具體步驟為：取0.2g或0.2mL樣品，溶解在2.0mL無水乙醇中充分抽提目標(biāo)檢品，抽提液靜止10分鐘使雜質(zhì)充分沉淀，取0.2mL上清液加入到20mL在含有0.05mg/mL他達(dá)那非檢測抗原的樣品檢測液，充分搖勻成為樣品檢測液，用滴管在樣品墊上滴加3-4滴液樣品檢測，羊抗兔IgG和他達(dá)那非及其類似物偶聯(lián)OVA結(jié)合物分別噴涂在NC膜的質(zhì)控線和檢測線T線，含他達(dá)那非及其類似物待測樣品經(jīng)S端根據(jù)層析原理向另一端移動，并先后越過檢測線和質(zhì)控線，由于樣品檢測溶液中存在檢測抗原，NC膜T線上的固相抗體和膠體金上標(biāo)記的抗體分別與檢測抗原結(jié)合，在NC膜T線位置形成雙抗體夾心免疫結(jié)合物，使T線顯色產(chǎn)生檢測信號，當(dāng)樣品中存在目標(biāo)檢品，免疫反應(yīng)就會被競爭阻斷，T線顏色會消失。