[發明專利]牛樟芝Laccase蛋白基因及其克隆和測序方法

在審

• 申請號: 201410770565.8
• 申請日: 2014-12-14
• 公開（公告）號: CN104711272A
• 公開（公告）日: 2015-06-17
• 發明（設計）人: 管榮良;陳國義;裘東輝;周龍;陳宇;王偉萍;王芳;王靜
• 申請（專利權）人: 上海勤生緣生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/02;C12N15/10
• 代理公司: 上海晨皓知識產權代理事務所(普通合伙) 31260
• 代理人: 成麗杰

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，特別涉及一種牛樟芝Laccase蛋白基因及其克隆和測序方法。

背景技術

漆酶(Laccase)是一種糖蛋白，肽鏈一般由500個左右氨基酸組成，糖配基占整個分子的10％～45％。糖組成包括氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、巖藻糖和阿拉伯糖等。由于分子中糖基的差異，漆酶的分子量隨來源不同會有很大差異，甚至來源相同的漆酶分子量也會不同。盡管漆酶的氨基酸序列同源性差異很大，一般不同來源的漆酶同源性低于50％，但其催化位點序列還是非常保守的。通過對漆酶蛋白質晶體結構的研究，發現漆酶具有3個銅離子結合位點，共結合有4個銅離子，根據它們的氧化還原電勢、光學和磁學特征劃分為三種類型。

第一類銅離子(Cu1)能與包括水在內的溶劑作用，各種銅離子絡合劑能將其除去導致酶的活性大大減少。第二類銅離子(Cu2)是由兩分子的咪唑和一分子的水配位形成松散的扭曲四面體幾何構型，所以很容易除去，在有氧條件下則不易除去。第三類銅離子(Cu3a，Cu3b)與三個組氨酸分子和一個氫氧化物分子形成受阻四面體幾何構型，在有氧分子存在時，這對銅離子由氫氧化物為橋結合在一起，Cu-Cu工價體產生強烈的反鐵磁性，檢測不到EPR光譜信號。這類二價復合物在330nm處的吸收隨活性位點的還原而消失。

漆酶能催化許多化合物的氧化反應，底物比較廣泛，包括許多對二酚結構類似的化合物，如氨基苯酚，鄰、對苯二酚，多胺，木質素和芳基二胺等。一些漆酶能高效的氧化抗壞血酸，另外一些真菌漆酶還能催化木質素和甲氧基酚酸的脫甲基反應。漆酶的抑制劑大多是銅離子螯合劑，有鹵化物、半胱氨酸、EDTA和SDS等，離子強度的不同也會影響酶的活力。不同來源的漆酶最適pH范圍也不同。

漆酶的活性與真菌的出芽、色素生產、木質素降解和病源發生相關，同時漆酶還可以保護真菌病原菌免受寄主植保素和鞣質等化合物的影響，所以漆酶被認為是重要的病原菌毒力因子。例如根病原菌Heterobasidionannosum的侵染性和漆酶緊密相關。

漆酶可存活于空氣中，發生反應后唯一的產物就是水，因此本質上是一種環保型酵素，存在菇、菌及植物中，有關真菌漆酶的研究與應用已有大量報道。真菌漆酶因為具有降解木質素、酚類物質的作用，所以在紡織、造紙、食品、飼料、環保等方面具有廣泛的應用潛力。分泌漆酶的主要真菌有黃孢原毛平革菌、彩絨革蓋菌、變色栓菌、射脈菌、鳳尾菇、香菇等，這些真菌都屬于擔子菌門。

漆酶在植物中主要起到合成木質素的作用，而真菌所分泌的漆酶作用恰恰相反，主要起降解木質素的作用，因此真菌漆酶對木質素的降解作用使漆酶具有廣泛的潛在應用價值。牛樟芝是珍貴的藥用真菌，是牛樟樹上發現的唯一腐木菌，但是樟芝的寄生病源性并不強，牛樟樹很少死亡，所以，研究牛樟芝的漆酶具有重要意義。本發明參考其它物種Laccase基因序列，克隆測序獲得牛樟芝Laccase基因的cDNA序列，并對不同物種Laccase基因的CDS序列進行同源性比較，旨在了解和驗證Laccase基因的結構特點，為今后研究Laccase基因與菌類漆酶提供基礎資料。

發明內容

本發明的一個目的在于提供一種牛樟芝Laccase蛋白基因。

本發明的另一個目的在于提供上述牛樟芝Laccase蛋白基因的克隆和測序方法。

為解決上述技術問題，本發明的實施方式提供了一種牛樟芝Laccase蛋白基因，該基因為一種漆酶的基因，具體來說，本發明的實施方式所提供的牛樟芝Laccase蛋白基因，該基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

同時，本發明的實施方式所提供的牛樟芝Laccase蛋白基因，其核苷酸序列編碼具有SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列的多肽。

本發明的實施方式還提供上述牛樟芝Laccase蛋白基因的克隆和測序方法，該方法包含以下步驟：

(1)組織分離：取牛樟芝菌絲，以重蒸水沖洗去除培養基及雜質，然后將組織樣迅速放入液氮中冷凍后于-70℃保存；

(2)總RNA的分離：從上述步驟(1)中凍存的組織樣中提取總RNA，通過分光光度計測定RNA含量，并采用瓊脂糖電泳分析進行總RNA的鑒定；