[發明專利]牛樟芝Laccase蛋白基因及其克隆和測序方法

在審

• 申請號: 201410770565.8
• 申請日: 2014-12-14
• 公開（公告）號: CN104711272A
• 公開（公告）日: 2015-06-17
• 發明（設計）人: 管榮良;陳國義;裘東輝;周龍;陳宇;王偉萍;王芳;王靜
• 申請（專利權）人: 上海勤生緣生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/02;C12N15/10
• 代理公司: 上海晨皓知識產權代理事務所(普通合伙) 31260
• 代理人: 成麗杰

1.一種牛樟芝Laccase蛋白基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

2.根據權利要求1所述的牛樟芝Laccase蛋白基因，其特征在于，所述的核苷酸序列編碼具有SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列的多肽。

3.一種牛樟芝Laccase蛋白基因的克隆和測序方法，其特征在于，包含以下步驟：

(1)組織分離：取牛樟芝菌絲，以重蒸水沖洗去除培養基及雜質，然后將組織樣迅速放入液氮中冷凍后于-70℃保存；

(2)總RNA的分離：從上述步驟(1)中凍存的組織樣中提取總RNA，通過分光光度計測定RNA含量，并采用瓊脂糖電泳法進行總RNA的鑒定；

(3)全長cDNA序列的克隆：以上述步驟(2)中獲得的總RNA為模板，設計并合成SEQ?ID?NO:3所示的正向引物和SEQ?ID?NO:4所示的反向引物，進行反轉錄-PCR擴增，以獲得牛樟芝Laccase蛋白基因cDNA序列，對cDNA序列進行克隆，得到重組質粒；

(4)測序：對上述步驟(3)中的重組質粒進行測序。

4.根據權利要求3所述的牛樟芝Laccase蛋白基因的克隆和測序方法，其特征在于，所述步驟(2)中從組織樣中提取總RNA時使用Trizol試劑進行提取。

5.根據權利要求3所述的牛樟芝Laccase蛋白基因的克隆和測序方法，其特征在于，所述步驟(3)中進行反轉錄-PCR擴增的反轉錄反應體系組成為：2×Bca?1st緩沖液10μl，25Mm的MgSO₄?4μl，dNTP?1μl，40U/μl的酶抑制劑0.5μl，22U/μl的反轉錄酶1μl，SEQ?ID?NO:3所示的正向引物0.5μl，SEQ?ID?NO:4所示的反向引物0.5μl，RNA模板1μl，無酶水1.5μl，總體系為20μl。

6.根據權利要求3所述的牛樟芝Laccase蛋白基因的克隆和測序方法，其特征在于，所述步驟(3)中進行反轉錄-PCR擴增的反轉錄反應條件為：65℃1分鐘，30℃5分鐘，15～30分鐘內勻速升溫，65℃25分鐘，98℃5分鐘，5℃5分鐘。

7.根據權利要求3所述的牛樟芝Laccase蛋白基因的克隆和測序方法，其特征在于，所述步驟(3)中進行反轉錄-PCR擴增的PCR擴增反應條件為：97℃變性5分鐘；然后以95℃30秒，55℃30秒，72℃1分鐘為一個循環，進行30次循環；最后72℃延伸10分鐘，4℃保存。

8.根據權利要求3所述的牛樟芝Laccase蛋白基因的克隆和測序方法，其特征在于，所述步驟(3)中對cDNA序列進行克隆的步驟包括：對反轉錄-PCR擴增片段回收DNA，將回收到的DNA片段同T載體連接，轉化到感受態細胞中，然后進行轉化菌落的PCR鑒定與培養，回收重組質粒，對回收到的重組質粒進行酶切鑒定和測序。