[發明專利]利用口腔上皮細胞制作單細胞測序參考品的方法有效

申請號：	201410769398.5	申請日：	2014-12-15
公開（公告）號：	CN104404034A	公開（公告）日：	2015-03-11
發明（設計）人：	梁波;孔令印;申靜靜;劉慧敏;孫丹鳳	申請（專利權）人：	賽業健康研究中心（太倉）有限公司
主分類號：	C12N15/10	分類號：	C12N15/10;C12Q1/68
代理公司：	上海卓陽知識產權代理事務所(普通合伙) 31262	代理人：	巫蓓麗
地址：	215400 江***	國省代碼：	江蘇;32
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摘要：
搜索關鍵詞：	利用口腔上皮細胞制作單細胞參考方法
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，具體地說，涉及利用口腔上皮細胞制作單細胞測序參考品的方法。

背景技術

隨著基因測序技術水平的提高以及千人基因組計劃、癌癥基因組計劃、Meta-Hit計劃等重大國際合作項目的相繼開展，基因組研究日漸被推向高潮。然而，迄今為止使用的測序材料無一例外都是數百萬甚至更多細胞的混合DNA樣本。這種方法能夠得到全基因組序列信息，但是對其進行研究得到的結果只是一群細胞中信號的平均值，或者只代表其中占優勢數量的細胞信息，單個細胞獨有的特性被忽視。另一方面，有些樣品稀少無法在實驗室培養，樣品量不足以進行全基因組分析，例如腫瘤循環細胞、組織微陣列、早期發育的胚胎細胞等。這些都是全基因組測序遇到的難題。近年來，流式細胞分選和激光捕獲顯微切割技術的出現以及單細胞全基因組擴增技術的不斷改進，讓大量單細胞的捕獲和檢測成為可能。單細胞測序技術正逐漸從實驗研究方法成為指導臨床的有利工具，也逐漸發展出很多的臨床應用。

目前基于單細胞水平的臨床應用研究主要集中在胚胎植入前檢測及腫瘤研究方面。

利用高通量測序技術對胚胎進行植入前遺傳學篩查(Preimplantation?Genetic?Screening，PGS)，是通過分離少量的胚胎細胞進行單細胞測序，從而檢測體外培養的胚胎染色體數目和結構異常，挑選正常的胚胎植入子宮，對獲得正常的妊娠，提高臨床妊娠率和活產率，降低多胎妊娠具有重要意義。而在技術研發過程中以及數據分析過程中，需要有相應的正常單細胞對照樣本進行對比分析。

腫瘤研究方面，腫瘤的異質性是目前研究較多的方向之一，腫瘤在生長過程中，由于其分裂增殖的無限性，突變率增加，其子細胞呈現出分子生物學或基因方面的改變，從而使腫瘤的生長速度、侵襲能力、對藥物的敏感性、預后等各方面產生差異。簡單點說就是同一腫瘤中可以存在有很多不同的基因型或者亞型的腫瘤細胞。因此同一種腫瘤在不同的個體身上可表現出不一樣的治療效果及預后，甚至同一個體身上的腫瘤細胞也存在不同的特性和差異。因此在單細胞水平上研究腫瘤細胞，對于腫瘤的檢測和研究甚至個體化醫療方面具有重要意義。而腫瘤單個細胞的研究同樣需要有正常的體細胞進行對照分析。

此外，基于臨床應用的試劑盒在開發過程中需要有對照樣本進行試劑盒的性能評價。在后續的試劑盒注冊審批過程中也需要有相應的標準品進行注冊檢驗。因此進行單細胞研究首先要建立單細胞對照樣本，但是由于臨床樣本的稀有和一系列社會學倫理學因素的制約，很難收集和處理臨床樣本。因此臨床上迫切需要一種可以用于單細胞研究的簡單有效的單細胞實驗材料和處理方法。臨床上常用的血液樣本在分離有核細胞時，通常會受到紅細胞等干擾，很難確保分離細胞的準確性。

綜上所述，亟需一種簡便準確的制作單細胞測序參考品的方法。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種。

利用口腔上皮細胞制作單細胞測序參考品的方法，包括以下步驟：

a)口腔上皮細胞獲得、保存：刮取口腔上皮細胞，保存在PBS溶液中；

b)分離單個口腔上皮細胞：在顯微鏡下，用毛細口吸管吸取單個口腔上皮細胞；

c)單細胞全基因組擴增：對單細胞樣本進行全基因組擴增，擴增后的樣本用磁珠法純化DNA；

d)DNA片段化：對擴增樣本進行酶切，用EDTA終止實驗，然后用磁珠法純化酶切產物；

e)Proton文庫構建：用DNA酶切后的產物進行文庫構建，DNA片段末端補平后純化，兩端加特異性接頭后純化，PCR擴增后純化；

f)Proton半導體高通量測序平臺進行上機測序：計算文庫的稀釋倍數，利用乳液PCR技術形成達到測序要求的陽性測序模板，利用半導體測序系統對測序模板進行測序，最終獲得每個DNA片段的堿基序列；

g)測序數據分析：將測序結果利用生物信息學分析把這些序列定位到人類基因組參考圖譜上，通過與參考基因組的對比分析樣本的信息。

步驟a)中，刮取口腔上皮細胞前先用涼開水漱口，保證刮取的細胞中不含有除口腔上皮細胞以外的其他成分。