[發明專利]利用口腔上皮細胞制作單細胞測序參考品的方法有效
| 申請號： | 201410769398.5 | 申請日： | 2014-12-15 |
| 公開（公告）號： | CN104404034A | 公開（公告）日： | 2015-03-11 |
| 發明（設計）人： | 梁波;孔令印;申靜靜;劉慧敏;孫丹鳳 | 申請（專利權）人： | 賽業健康研究中心（太倉）有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/10 | 分類號： | C12N15/10;C12Q1/68 |
| 代理公司： | 上海卓陽知識產權代理事務所(普通合伙) 31262 | 代理人： | 巫蓓麗 |
| 地址： | 215400 江*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 利用 口腔 上皮細胞 制作 單細胞 參考 方法 | ||
1.利用口腔上皮細胞制作單細胞測序參考品的方法，其特征在于，包括以下步驟：
a)口腔上皮細胞獲得、保存：刮取口腔上皮細胞，保存在PBS溶液中；
b)分離單個口腔上皮細胞：在顯微鏡下，用毛細口吸管吸取單個口腔上皮細胞；
c)單細胞全基因組擴增：對單細胞樣本進行全基因組擴增，擴增后的樣本用磁珠法純化DNA；
d)DNA片段化：對擴增樣本進行酶切，用EDTA終止實驗，然后用磁珠法純化酶切產物；
e)Proton文庫構建：用DNA酶切后的產物進行文庫構建，DNA片段末端補平后純化，兩端加特異性接頭后純化，PCR擴增后純化；
f)Proton半導體高通量測序平臺進行上機測序：計算文庫的稀釋倍數，利用乳液PCR技術形成達到測序要求的陽性測序模板，利用半導體測序系統對測序模板進行測序，最終獲得每個DNA片段的堿基序列；
g)測序數據分析：將測序結果利用生物信息學分析把這些序列定位到人類基因組參考圖譜上，通過與參考基因組的對比分析樣本的信息。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a)中，刮取口腔上皮細胞前先用涼開水漱口，保證刮取的細胞中不含有除口腔上皮細胞以外的其他成分。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a)中，刮取口腔上皮細胞時，用干凈的牙簽平貼口腔兩側頰部，輕輕刮取口腔上皮細胞，避免損傷口腔內壁。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟b)中，在吸取單個口腔上皮細胞之前，根據PBS溶液中細胞的密度在培養皿上進行梯度稀釋，從最后稀釋的液體中吸取單個口腔上皮細胞。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟b)中，用毛細口吸管吸取單個口腔上皮細胞時，先讓毛細管插入干凈的PBS溶液中使其自然虹吸結束后拿出再進行單個口腔上皮細胞的吸取。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟e)中，所述的純化是采用磁珠法純化。
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