[發明專利]遺傳性血管水腫的檢測試劑盒及其制備方法

在審

• 申請號: 201410768922.7
• 申請日: 2014-12-11
• 公開（公告）號: CN105527419A
• 公開（公告）日: 2016-04-27
• 發明（設計）人: 白彩明
• 申請（專利權）人: 北京新華聯協和藥業有限責任公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/577
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發明涉及檢測試劑盒領域，具體地說，涉及一種遺傳性血管水 腫的檢測試劑盒及其制備方法。

背景技術

遺傳性血管水腫(hereditaryangioedema，HAE)是一種以反復 發作的皮下和(或)黏膜下水腫為主要表現的罕見遺傳性疾病。水腫 為自發性或由某些因素誘發，具有局限性、非凹陷性、自限性的特點。 常見受累部位包括顏面部、四肢、消化道及上呼吸道黏膜。

典型的HAE是由補體C1酯酶抑制劑(C1inhibitor，C1-INH)基 因突變導致的C1-INH量的減少和(或)功能缺乏所致。遺傳性血管 水腫是一種常染色體先行遺傳病，發病率1/50000。

由于HAE發病率低，臨床上易發生誤診、誤治。該疾病的診斷除 需要了解家族史和根據典型的臨床表現外，主要依賴于實驗室對 C1-INH功能活性檢測。近年來，國外較多推薦采用比色法對C1-INH 的功能進行檢測。但比色法的靈敏度和特異性較低，且操作較復雜， 用時較長。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種遺傳 性血管水腫的檢測試劑盒及其制備方法。

為了實現本發明目的，本發明首先提供一種遺傳性血管水腫的檢 測試劑盒，所述試劑盒包括：包被抗人C1-INH抗體的載體、生物素 標記的C1-INH校準品、鏈霉親和素偶聯的辣根過氧化酶試劑、化學 發光底物液A和B以及洗滌液。

進一步地，所述載體為化學發光板或磁珠微粒。

進一步地，所述抗人C1-INH抗體選自鼠抗人C1-INH單克隆抗體、 兔抗人C1-INH多克隆抗體、羊抗人C1-INH的多克隆抗體、雞抗人 C1-INH多克隆抗體中的一種或多種。

作為優選，所述抗人C1-INH抗體選自鼠抗人C1-INH單克隆抗體。

進一步地，所述鼠抗人C1-INH單克隆抗體的純度不小于95％，濃 度不小于1mg/mL。

作為優選，所述抗人C1-INH抗體濃度為5μg/mL。

本發明還提供了所述試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

(1)包被抗人C1-INH抗體的載體的制備：

包被抗人C1INH抗體的96孔化學發光板：將包被用抗人C1-INH 抗體加至碳酸鹽緩沖液中混勻，加入微孔板內，每孔100μL，包被濃 度1～5μg/mL，4℃過夜，用含Tween20的磷酸鹽緩沖液洗滌微孔板 2遍后，再加入含有BSA的磷酸鹽緩沖液，室溫靜置2小時后，棄 去孔內液體，徹底干燥發光板，于鋁箔袋真空包裝，放2-8℃保存；

或包被抗人C1-INH抗體的磁珠微粒：將直徑0.15μm的磁珠微 粒用戊二醛活化，室溫混勻2～5小時候，用0.01mol/LPBS緩沖液 沖洗4次，并將該溶液進行懸浮，濃度為0.1mg/mL～2.5mg/mL；然 后，每毫升懸液中加入抗人C1-INH抗體10μg，于20～40℃混勻孵 育3～10小時；用等體積的0.01MPBS2％～5％BSApH7.0～7.4緩沖 液于20～40℃孵育2～8小時；最后，用2％BSA0.01～0.1MTris-HCl pH7.5～pH9.0緩沖液清洗三次，并用該溶液配制成磁珠微粒濃度 0.1～1.0mg/mL，即得；

(2)生物素標記的C1-INH校準品的制備：將C1-INH用0.1 mol/L，pH8.0的碳酸氫鈉緩沖液或0.5mol/L，pH8.6的硼酸緩沖液 稀釋到1mg/mL，并用0.1mol/L，pH8.0的碳酸氫鈉緩沖液或0.5 mol/L，pH8.6的硼酸緩沖液，對蛋白質充分透析；用1mLDMSO溶 解NHSB1mg；向1mLC1-INH溶液(即含蛋白質1mg)加入120μl NHSB溶液(即含NHSB120μg)；在室溫下持續攪拌，保溫2-4小 時；加入9.6μL1mol/LNH₄Cl(每25μgNHSB加1μl)，在室溫下攪 拌10分鐘；在4℃，對PBS充分透析，以除去游離的生物素；將樣 品上1mL的分子篩柱，以PBS緩慢洗脫，收集1mL/管，蛋白質在 1-3mL之間洗下；最后，樣品加入疊氮鈉(終濃度0.5g/L)及1.0g/LBSA. 將結合產物置4℃，避光保存；